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口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）、小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR）和羊痘（capripox，CP）是危害山羊、绵羊等小型反刍动物的3种重大疫病，均为世界动物卫生组织（OIE）发布的A类烈性传染病。3种疫病的病原分别是口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）、小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）和羊痘病毒（capripoxvirus，CPV）。目前这3类疫病的防控主要依靠灭活苗或弱毒苗，在实际应用中存在着免疫持续期短、热稳定性差、病毒毒力有返强风险等诸多缺陷。因此，需要研制更为安全高效的新型疫苗。病毒载体是现代生物科学研究的热点之一，诸多病毒载体已成功构建，并成为研制新型疫苗的候选工具。羊痘病毒活载体就是其中之一。在上述3种感染羊的病毒中，PPRV的H蛋白和F蛋白是刺激机体产生中和抗体的主要抗原；而FMDV的P1-2A在3C的作用下可以形成病毒的核衣壳，是中和抗体产生的主要诱导物，其中P1蛋白中的VP1片段是抗原决定簇最集中的区域，因此，PPRV的H和F基因、FMDV的VP1基因和P12A3C片段是研制亚单位疫苗和重组疫苗的主要候选基因。本研究利用DNA重组技术，构建用于羊痘病毒重组的基因工程转移载体，通过转移载体和病毒之间的同源重组，将PPRV和FMDV的抗原基因分别插入到羊痘病毒基因组中，形成重组羊痘病毒，作为转运外源蛋白的活载体，旨在研制一种能有效预防PPR、羊FMD、羊痘的高效疫苗。获得结果如下：1.构建了重组转移质粒ptkpp，并通过延长重组同源臂、插入报告基因GFP和压力筛选基因gpt、引入多克隆位点，优化了其功能，最后形成了可重复使用的转移质粒pftkpgigp和pftkpgigpi；验证了重组转移质粒启动子p7.5和p11的功能，为此系列质粒的正常使用奠定了基础。2.将PPRV和O型FMDV的抗原基因分别插入转移质粒pftkpgigp和pftkpgigpi的多克隆位点中，构建了6个重组质粒：pftkpgigp-H、pftkpgigp-F、pftkpgigp-VP1、pftkpgigp-P12A3C、pftkpgigp-H-i-P12A3C、pftkpgigp-F-i-P12A3C，以用于和羊痘病毒的同源重组。3.用脂质体转染法将6个重组转移质粒分别导入预先感染羊痘病毒的羔羊睾丸细胞中，经同源重组获得了6株重组羊痘病毒第一代混悬液。然后用选择培养液反复培养筛选纯化，通过GFP的表达、细胞病变效应以及PCR法检测，初步鉴定形成了4株重组GPV，分别命名为rGPV/FMDV-VP1（携带FMDV VP1基因）、rGPV/PPRV-F（携带PPRV F基因）、rGPV/PPRV-H（携带PPRV H基因）、rGPV/PPRVF-FMDVP12A3C（携带PPRV F基因和FMDV的P12A3C片段）。4.4株rGPV分别感染LT细胞，经RT-PCR检测mRNA的转录状况，后用间接免疫荧光技术检测外源基因的表达。结果显示，所有插入的外源基因得到了正常转录，其表达产物与特异性抗体之间产生了良好的免疫反应。5.4株rGPV按105TCID50剂量经皮内接种山羊，分别诱导产生了较高水平的抗GPV、FMDV和PPRV抗体；产生的抗GPV抗体效价和GPV疫苗差异不显著，抗FMDV抗体效价和疫苗组差异显著，抗PPRV效价在加强免疫后和疫苗组差异不显著。