高原低氧环境导致的高原性疾病及老年人心脑血管疾病频发的挑战日趋紧迫,抗低氧药物的研发受到越来越多的瞩目。我们实验室前期一直在进行抗低氧药物的筛选。在筛选过程中,我们发现了一种具有抗低氧保护作用的新单体化合物——5-羟基糠醛(5-HMF),并且在离体水平验证其保护作用,对其作用机制进行了初步探讨。　　 5-HMF全称为5-羟-2-甲基糠醛,其可由己糖经加热分解产生,广泛存在于含有糖类的植物和食品中。大量研究表明,5-HMF具有抗氧化、抗镰刀性贫血病以及改善血液流变学的保护作用。为了进一步验证它在整体水平的作用,我们观察和分析了5-HMF预处理对急性低压低氧所致小鼠脑损伤的影响。　　 低氧可激活多种信号通路,而调控信号转导途径对低氧性疾病的防治十分重要,以信号转导上游转录因子为靶标的药物筛选成为调控治疗的新宠。低氧诱导因子(HIF-1)是机体组织细胞在低氧条件下起重要调节作用的一种关键的转录因子。由于其能够调控下游大量靶基因使机体适应各种应激反应,其激活可能有助于低氧损伤的预防及修复,因而HIF-1成为一个有效的治疗低氧/缺血疾病的分子靶标。　　 HIF-1是由α和β两个亚基组成的异二聚体蛋白,其中α亚基是它的活性调控亚基。HIF-1α在常氧条件下十分容易降解,稳定HIF-1α蛋白表达及激活其转录活性都依赖于对HIF-1α的羟基化修饰。在此过程中,脯氨酸羟化酶、2-酮戊二酸(2-OG)、亚铁离子和维生素C(Vc)发挥了十分重要的作用。影响HIF-1α的羟基化过程,将有助于稳定HIF-1α蛋白,这一基本原理在开发防治低氧损伤的药物研制中将发挥重要作用。本文首次观察与分析了5-HMF对HIF-1α的稳定作用及其作用机制。　　 1.5-HMF对急性低压低氧所致小鼠脑损伤的影响　　 1.1观察5-HMF对小鼠急性致死性低压低氧耐受的影响,确认其保护作用　　 利用密闭低氧舱建立小鼠急性低压低氧模型(9500±50 m),100 mg/kg的5-HMF腹腔注射1 h后,观察小鼠急性低压低氧环境下的存活时间和存活率。结果显示,与空白对照组比较,5-HMF预处理组小鼠存活时间明显延长,小鼠的存活率明显升高。　　 1.2分析5-HMF对急性低压低氧所致脑损伤的可能保护作用途径　　 以上结果显示,5-HMF可以提高小鼠对急性致死性低压低氧的耐受,具有明显的保护作用。5-HMF抗低氧作用的机制如何?我们推测,5-HMF的抗低氧保护作用可能与减轻急性低压低氧造成的小鼠脑损伤有关。为探讨其保护机制,实验选用100 mg/kg的5-HMF预处理小鼠,进行亚致死性低压低氧6 h后,观察对血脑屏障(BBB)通透性的影响,皮层和海马CA1组织细胞形态的影响,以及对小鼠皮层和海马组织内MAPK家族ERK、JNK和p38蛋白表达的影响,最后分析5-HMF对低氧损伤的保护机制。　　 1.2.1采用伊文思蓝梁色的方法检测小鼠血脑屏障的完整性。结果显示,急性低压低氧6 h后,小鼠脑组织中伊文思蓝的漏出率明显升高,而100 mg/kg的5-HMF预处理后,小鼠脑组织中伊文思蓝的漏出率明显降低。　　 1.2.2采用苏木精-伊红染色的方法检测小鼠皮层和海马CA1组织细胞的形态变化。结果显示,急性低压低氧6 h后,小鼠大脑皮层和海马CA1细胞排列松散、细胞形态受损、胞核皱缩甚至消失,而100 mg/kg的5-HMF预处理后,小鼠大脑皮层和海马CA1细胞排列变紧密、部分细胞形态变规则。　　 1.2.3采用免疫印迹的方法检测小鼠皮层和海马组织中ERK、JNK和p38蛋白的表达变化。结果显示,急性低压低氧6 h后,小鼠脑组织中ERK磷酸化水平明显升高,JNK和p38蛋白磷酸化水平变化不大,而100 mg/kg的5-HMF预处理后,小鼠脑组织中ERK磷酸化水平明显降低,但对JNK和p38蛋白磷酸化水平影响不大。　　 以上实验结果表明:5-HMF具有减轻急性低压低氧所致脑损伤的作用,其保护作用可能与维持血脑屏障的完整性、减轻脑细胞的损伤以及抑制ERK蛋白的磷酸化有关。　　 2.5-HMF稳定HIF-1α的作用及其机制探讨　　 2.15-HMF对HIF-1α的稳定作用　　 为了观察5-HMF是否可以抑制HIF-1α蛋白的降解使其得到稳定,实验选用ODD-Luc小鼠(一种可以在体评估HIF-1α稳定性的转基因小鼠),采用氯化钴(CoCl2)作为阳性对照,通过不同剂量的5-HMF作用不同时间,观察5-HMF对小鼠整体荧光强度的影响(反映5-HMF对HIF-1α稳定性的作用),用免疫印迹方法验证5-HMF对小鼠脑、肾组织中HIF-1α蛋白的影响,并用RT-PCR方法检验5-HMF对小鼠脑、肾组织中HIF-1下游靶基因VEGF mRNA表达的影响。　　 2.1.1采用不同剂量的5-HMF作用不同时间,观察其对小鼠整体荧光强度的影响。结果显示,125 mg/kg的阳性对照CoCl2可以明显增强小鼠脑、肾区的荧光强度,而100 mg/kg的5-HMF作用1-2 h可以稳定增强小鼠脑、肾区的荧光强度。该实验提示5-HMF在常氧下能够稳定HIF-1α。　　 2.1.2采用免疫印记的方法观察5-HMF对小鼠脑、肾组织中HIF-1α蛋白的影响。结果显示,125 mg/kg的阳性对照CoCl2可以明显增加小鼠脑、肾织中的HIF-1α蛋白水平,同样地,100 mg/kg的5-HMF作用1 h也可以明显增加小鼠脑、肾组织中的HIF—1α蛋白水平。　　 2.1.3采用RT-PCR的方法检测5-HMF对小鼠脑、肾组织中HIF-1下游靶基因VEGFmRNA麦达的影响。结果显示,125 mg/kg的阳性对照CoCl2可以明显增强小鼠脑、肾织中VEGF的mRNA水平,而100 mg/kg的5-HMF作用1 h也可以明显增强小鼠脑、肾组织中VEGF的mRNA水平。　　 2.25-HMF稳定HIF-1α的作用机制探讨　　 以上结果显示,5-HMF可以抑制HIF-1α的降解,稳定功能性的HIF-1α。那么,5-HMF稳定功能性HIF-1α的作用机制是什么呢?我们推测,HIF-1α蛋白的羟基化修饰过程可能参与其中。为探讨其作用机制,实验选用对低氧敏感的PC12细胞,继续采用CoCl2作为阳性对照,在细胞水平进一步验证了5-HMF对HIF-1α的稳定作用。接下来,我们观察了5-HMF对HIF-1α羟基化过程中发挥重要作用的2-酮戊二酸、亚铁离子以及Vc的影响,首先通过分别检测5-HMF在体外与它们之间是否存在直接结合,结果发现5-HMF只与Vc在体外结合,然后观察加入5-HMF后细胞内Vc的含量变化,以及补加外源性的Vc对5-HMF处理后HIF-1α蛋白稳定性的影响,分析5-HMF稳定功能性HIF-1α的可能作用机制。　　 2.2.1采用免疫印迹和免疫荧光的方法观察5-HMF对PC12细胞中HIF-1α蛋白含量和分布的影响。结果显示,250μM的CoCl2阳性对照可以明显升高PC12细胞中的HIF-1α蛋白含量,而100μg/ml的5-HMF作用1 h也可以明显升高PC12细胞中的HIF-1α蛋白含量。同时,CoCl2和5-HMF均引起PC12细胞中HIF-1α蛋白的荧光表达增强,并有明显入核现象。　　 2.2.2采用紫外分光光度的方法检测5-HMF与2-酮戊二酸、亚铁离子以及Vc之间是否存在直接结合。结果显示,2-酮戊二酸和亚铁离子不影响5-HMF的紫外吸收值,而Vc引起5-HMF紫外吸光值的蓝移,提示二者可能存在直接结合。　　 2.2.3采用分光光度的方法检测5-HMF对PC12细胞中Vc含量的影响。结果显示,　　 100μg/ml的5-HMF作用1 h明显降低PC12细胞中的Vc含量。　　 2.2.4采用免疫印迹的方法检测补加外源性Vc对5-HMF处理后HIF-1α蛋白水平的影响。结果显示,5-HMF可以明显升高PC12细胞中的HIF-1α蛋白含量,而补加外源性的Vc可以在一定程度上降低5-HMF引起的HIF-1α蛋白升高。同时,补加外源性的Vc可以逆转5-HMF引起的ODD-Luc小鼠荧光增强,并呈现一定的剂量依赖性。　　 以上实验结果表明:5-HMF稳定功能性HIF-1α的作用可能与直接结合Vc,降低细胞内Vc的含量,抑制HIF-1α的降解有关。　　 3结论：　　 3.1首次证实5-HMF可以减轻急性低压低氧造成的脑损伤,具有保护作用,提示5-HMF可能对高原低氧性疾病的防治具有潜在价值。　　 3.25-HMF抗急性低压低氧的保护作用可能与维持血脑屏障的完整性,减轻脑水肿以及抑制ERK蛋白磷酸化有关。　　 3.3首次证明5-HMF具有稳定功能性HIF-1α的作用,为低氧及缺血性疾病的防治提供新的依据和研究思路。　　 3.45-HMF稳定HIF-1α的作用可能通过直接结合Vc,降低细胞内Vc的含量,抑制HIF-1α的降解有关。