花背蟾蜍蝌蚪晶状体的再生及相关Pax-6基因全长cDNA克隆和表达分析

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以无尾两栖类(Anuran)花背蟾蜍(Bufo Raddei Strauch)后肢芽期蝌蚪为实验材料,摘除其左眼晶状体,在再生不同时期固定,石蜡连续切片,苏木精-伊红对染,光镜观察,研究晶状体再生的组织来源;另外,选再生不同时期材料用戊二醛,锇酸固定,透射电镜观察,以研究晶状体再生组织的超微结构变化。结果表明:花背蟾蜍蝌蚪(1)具有晶状体再生的能力,其晶状体的再生来源于虹膜背缘的上皮细胞;(2)虹膜背缘去色素是转分化的前提,主要有两种方式:一种也是最主要的方式是在晶状体被摘除后虹膜外侧产生巨噬细胞,巨噬细胞吞噬虹膜色素上皮细胞中的色素颗粒;另一种方式是虹膜色素上皮细胞自身释放色素颗粒;(3)电镜观察发现虹膜色素上皮细胞转分化过程中线粒体有明显变化,核糖体增多,粗面内质网增多,晶状体纤维分化过程中细胞核逐渐凝聚。Pax6基因又称为同源异形框(盒)基因(homeobox genes,Hox)其表达方式高度保守,在脊椎动物中Pax-6基因在眼组织中的表达对眼的结构发育和细胞的分化是必需的。选择花背蟾蜍18期的蝌蚪胚胎作为实验材料,设计兼并引物克隆新物种基因;使用由5′及3′RACE得到的序列信息设计新的引物,采用RACE(Rapid Ampliphication of cDNA Ends)的方法以及RNaseH-的逆转录酶和高保真的热稳定聚合酶对序列进行扩增,成功的得到了花被蟾蜍Pax6基因的全长cDNA克隆。对该全长基因进行生物信息学分析,包括载体序列的去除,基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)的预测,基因编码蛋白序列翻译,与其他物种同源性的比对。发现花背蟾蜍Pax-6基因与非洲爪蟾和人类该基因的同源性分别高达85%和84%,在其他的物种中也有相当高的同源性。这是一个在进化上相当保守的基因,说明了该基因在眼睛和晶状体发育过程中的重要作用和在进化过程中的重要地位。实验条件下建立胚胎晶状体发育的时期梯度模型和晶状体再生的时期梯度模型,采用荧光定量PCR(Real—Time PCR)技术,对胚胎晶状体发育不同时期和晶状体摘除后再生不同时期Pax-6基因PCR扩增产物进行了实时监控,并对该基因的表达模板量进行了相对定量分析,得到了在花背蟾蜍晶状体发育和再生过程中该基因表达量的一系列变化,结果表明:(1)在胚胎发育的时期梯度模型中显示了两个表达量的峰值,从12到19期形成一个明显的以神经管期(16期)为最高的表达趋势,而在鳃血循环期(20期)又出现了一个新的表达高峰。(2)荧光定量PCR结果显示在花背蟾蜍的晶状体再生的第7天Pax-6基因的表达量达到最高,表明此时期Pax-6基因在晶状体再生的过程中起到调控细胞增殖的作用。晶状体再生的第30天晶状体纤维开始分化,荧光定量的结果显示再生30天比21天Pax6基因的表达量高,表明在此时期Pax-6基因对再生的过程中调控晶状体纤维分化方面起到了关键的调控作用。初步验证了该基因在花背蟾蜍晶状体发育和再生过程中是发挥调控细胞增殖和晶状体纤维的分化的作用。以上的研究结果为深入探讨Pax-6基因和相关蛋白在晶状体再生修复过程中的作用机理奠定了良好的基础。
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