结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染引起的严重危害全球公共卫生的慢性传染病。世界卫生组织2012年的统计数据显示，2011年全球结核病新发病例约为870万，其中13％为HIV共感染，140万人死于结核病，全球结核病疫情仍然十分严峻。随着HIV感染的流行，非结核分枝杆菌(non-tuberculosismycobacterium，NTM)疾病近年来呈现快速增多趋势。鸟分枝杆菌复合物（Mycobacteriumaviumcomplex，MAC）是临床NTM感染中最常见的病原菌，往往在晚期AIDS病人中造成细菌弥散性感染，导致极高的患病率和死亡率。在实验室培养条件下，分枝杆菌能够形成被称为生物膜的多细胞聚集体。生物膜的形成与分枝杆菌的耐药性和持留能力密切相关。　　 生物膜是在固体表面或气液界面形成的由胞外基质包裹的多细胞聚集物，多数细菌在环境中都以生物膜的形式存在。生物膜的形成有助于保护细菌细胞免受环境伤害，比如营养缺乏、抗生素处理、哺乳动物免疫系统攻击等，并有利于其分散定植到新的生境。分枝杆菌中的很多种类都能形成生物膜，包括结核分枝杆菌M.tuberculosis，鸟分枝杆菌M.avium，海分枝杆菌M.marinum，偶发分枝杆菌M.fortuitum,溃疡分枝杆菌M.ulcerans，脓肿分枝杆菌M.abscessus，耻垢分枝杆菌M.smegmatis等。结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌生物膜中含有耐受药物的持留子，它们对药物的耐受能力比浮游状态的细菌和生物膜缺陷的突变株高几个数量级。虽然目前没有确切的证据表明结核分枝杆菌能够在宿主体内形成生物膜，但有研究提示生物膜可能是结核菌在宿主体内的一种生活形式，并有利于其耐药和持留。分枝杆菌生物膜的结构、胞外基质的组成以及生物膜形成的分子机制和调控网络尚未明确。影响分枝杆菌生物膜形成的因素较多。培养条件，比如金属离子的加入量以及CO2的浓度对分枝杆菌生物膜的成熟有重要作用。聚酮合成酶Pks1的插入突变，青霉素结合蛋白DacB2的过表达以及多聚磷酸盐的缺失会改变生物膜的形成能力。而枝菌酸和糖肽脂这两种细胞壁上的成分的改变会显著影响生物膜的形成。　　 糖肽脂(glycopeptidolipids，GPLs)是位于分枝杆菌细胞壁最外层的糖脂，由非结核分枝杆菌产生，其结构由D-苯丙氨酸-D-别苏氨酸-D-丙氨酸-L-丙氨醇构成的三肽氨基醇与3-羟基或者3-甲氧基C26-C34脂肪酸通过肽键连接形成。GPLs在分枝杆菌的生理和致病性方面发挥着重要作用。GPLs能够显著影响分枝杆菌生物膜的形成，但具体的机制尚不清楚。生物膜的形成过程可能涉及治疗分枝杆菌的药物靶标，能够抑制生物膜形成的药物也许能大大缩短用标准抗生素对结核的治疗时间，对全球健康产生深远影响。因此，我们从实验室已构建的耻垢分枝杆菌转座插入突变库中筛选生物膜形成缺陷的突变菌株，初步研究突变基因影响生物膜的机制。　　 通过培养观察耻垢分枝杆菌转座插入突变库中部分突变株的生物膜形态，我们筛选获得突变株M454。在Middlebrook7H9液体培养基液面，野生株形成具褶皱的成熟的生物膜，其结构致密均一，薄而透明，韧性较好。突变株M454所形成的生物膜通常不具褶皱，结构疏松，较厚而不透明，具有孔样结构，轻摇易裂，具有石蜡样特征，但长时间不降解。突变株生物膜能够粘附在聚苯乙烯(PS)表面，但粘附量较野生株显著降低。用结晶紫染色法和干重法对生物膜进行定量分析，发现突变株生物膜形成量较野生株显著降低。采用质粒挽救法确定转座插入位点在基因MSMEG_0402(mps2)的4282bp与4283bp之间。mps2位于耻垢分枝杆菌GPLs生物合成基因簇中，大小为7680bp，编码一个非核糖体肽合成酶，负责GPLs脂肽核心中氨基醇的合成。mps2与下游基因MSMEG_0403位于同一操纵子，它的插入突变可能影响MSMEG_0403的表达。我们构建了含有MSMEG0403重组质粒的突变株，并检测了其生物膜的形态，发现其生物膜较突变株厚度降低，但生物膜的量更少。这一结果提示我们，mps2基因的插入突变可能影响到了下游基因MSMEG_0403的表达，突变株生物膜的表型可能不是mps2一个基因的功能缺失所致。　　 我们对突变株M454的生物学性质进行研究，发现mps2突变后突变株不产生GPLs，而从野生株获得的GPLs粗提物在TLC检测时出现5个斑点。MALDI-TOFMS检测结果提示，野生株GPLs样品中包含5类GPLs混合物。不同种类的GPLs，其结构差异主要体现在鼠李糖和脂肪酸链的甲基取代上。同时，野生株中可能包含仅有一个甲基取代的鼠李糖的GPLs，而这种情况通常出现在鼠李糖甲基转移酶缺失突变株中。与野生株比较，突变株脂肪酸组成没有发生改变，单菌落形态干燥粗糙，滑动能力完全缺失，细胞聚集度和细胞壁脂溶性显著增加。两菌株对分枝杆菌噬菌体TM4和D29敏感性一致，对利福平、异烟肼、卷曲霉素、链霉素和万古霉素的敏感性一致。在压力环境耐受实验中，我们发现两菌株对双氧水处理、SDS处理和酸性环境的耐受性一致，但突变株对碱性环境敏感。mps2的突变降低了耻垢分枝杆菌在巨噬细胞中的存活率，提示GPLs能够促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞中的存活。　　 突变株M454在单菌落形态和生物膜形态上出现的显著差异，是否是由于细胞形态改变所致？mps2基因突变是通过什么方式影响耻垢分枝杆菌生物膜的？为了探究这些问题的答案，我们进行了单细胞和生物膜超微结构检测。结果显示，突变株单细胞形态和大小没有发生变化。突变株生物膜孔洞较多，微菌落间缺少粘连物。我们推定突变株生物膜的变化是由胞外基质的变化造成的。TLC检测两菌株胞外基质成分发现，在365nm下，野生株样品出现两个蓝色荧光斑点;10％硫酸乙醇溶液显色后，突变株出现一个浅棕色斑点。两菌株各自所特有的斑点对应的化学物质可能是胞外基质中造成生物膜形态差异的成分。突变株生物膜胞外基质中的特有斑点可能是造成其生物膜寿命延长的分子。同时，胞外基质主要成分短链枝菌酸在突变株生物膜中缺失，其产生基因MSMEG_1529在突变株生物膜形成时，转录水平显著降低，我们推测mps2的突变可能通过影响包括MSMEG_1529在内的参与生物膜胞外基质形成的基因的表达造成胞外基质中短链枝菌酸的缺失，导致耻垢分枝杆菌生物膜形成缺陷。