研究背景卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。根据最新统计资料分析,卵巢癌在中美两国的发病率分别居妇科恶性肿瘤中的第三位及第二位,但其死亡率均高居妇科恶性肿瘤之首。由于卵巢癌发病初期临床症状较为隐匿,且缺乏敏感性和特异性高的早期检测手段,约75%的患者在确诊时疾病已经进展到FIGO Ⅲ期或Ⅳ期。尽管近年来肿瘤细胞减灭术和以铂类药物为基础的一线化疗作为卵巢癌的标准治疗方案已被广泛应用,但卵巢癌患者总体的5年生存率仍低于45%,且大部分晚期患者会在18个月内出现复发甚至化疗耐药的情况。因此,研究新型化疗药物及其作用机制并开发有效的替代治疗策略对于改善晚期卵巢癌患者的预后至关重要。凋亡抵抗是卵巢癌细胞出现化疗耐药的常见原因之一,所以诱导除凋亡以外的细胞死亡模式并探究其机制有利于开发针对复发耐药性晚期卵巢癌的新疗法。副凋亡(Paraptosis)是近年来新发现的一种以内质网和/或线粒体肿胀导致的广泛性胞质空泡化为特征的程序性细胞死亡模式。发生副凋亡的细胞缺少细胞凋亡常见的特征,例如核固缩、凋亡小体形成、DNA片段化、caspase激活等。副凋亡途径可能与MAPKs的激活相关,并且可被Alix蛋白和蛋白合成抑制剂环己酰亚胺抑制。另外,多项研究表明内质网应激、活性氧生成、线粒体钙超载等也参与了不同刺激所诱导的副凋亡过程。尽管近年来关于副凋亡这种细胞死亡模式的研究日渐增多,但其发生机制仍不甚明确,有待进一步探索。目前许多研究已经报道了多种天然化合物可以诱导肿瘤细胞发生副凋亡从而发挥抗癌活性。Morusin(桑辛素)是由日本Nomura等人于1982年首次从鸡桑(Morus australis)的根皮提取物中分离出的一种异戊烯基黄酮类天然化合物,具有抗炎、抗氧化、抗菌等多种生物学活性。此外,现有研究显示Morusin对结直肠癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多种实体肿瘤均具有一定的抗肿瘤效应。目前对于Morusin发挥抗肿瘤效应的研究主要集中于其可通过抑制NF-κ B信号通路和STAT3信号通路来诱导多种癌细胞发生细胞凋亡这方面的机制。尚无研究针对Morusin对卵巢癌有无抗肿瘤效应进行报道,并且Morusin能否诱导除凋亡以外的其他细胞死亡方式的发生仍需进一步探究。本研究首次探究了天然化合物Morusin对卵巢癌是否具有抗肿瘤效应以及该药物诱导卵巢癌细胞死亡所涉及的的主要细胞死亡模式及机制,并在荷瘤裸鼠的体内实验中进一步证实,为卵巢癌替代治疗药物的研发提供新思路。第一部分Morusin对卵巢癌细胞的抗肿瘤效应及其对细胞凋亡、坏死性凋亡和自噬的影响研究目的:1.检测Morusin对卵巢癌细胞A2780、SKOV-3及HO-8910是否有抗肿瘤效应。2.探讨Morusin对卵巢癌细胞A2780及SKOV-3凋亡、坏死性凋亡和自噬途径的影响。研究方法:应用MTT试验检测Morusin对卵巢癌细胞A2780、SKOV-3及HO-8910存活率的影响以及Z-VAD-fmk、Necrostatin-1、3-MA或氯喹预处理对Morusin作用后的A2780及SKOV-3细胞的存活率的影响;应用平板克隆试验检测Morusin对A2780、SKOV-3及HO-8910细胞克隆形成能力的影响;采用EdU掺入法检测Morusin对A2780和SKOV-3细胞增殖能力的影响;通过倒置相差显微镜观察Morusin对A2780、SKOV-3及HO-8910细胞形态的影响;通过Western blot试验检测凋亡相关蛋白PARP、caspase-3/9和相应剪切片段以及自噬相关蛋白LC3、p62、CTSB和CTSD的表达水平;应用DNA ladder法检测Morusin作用后A2780及SKOV-3细胞的DNA电泳条带变化;应用EBSS诱导A2780细胞自噬流的活化,应用氯喹阻断A2780细胞的自噬流;通过转染自噬双标腺病毒检测Morusin作用后A2780及SKOV-3细胞中自噬流的变化情况;应用透射电子显微镜技术检测Morusin作用后A2780及SKOV-3细胞中超微结构的变化情况。研究结果:1..Morusin对A2780、SKOV-3和HO-8910细胞存活率及增殖能力的影响:应用MTT试验检测Morusin对于卵巢癌细胞的存活率的影响,结果显示:Morusin明显抑制了 A2780、SKOV-3及HO-8910细胞的存活率,并且这种抑制作用具有浓度和时间依赖性。然后采用EdU掺入法检测Morusin对卵巢癌细胞增殖能力的影响,结果显示:Morusin有效抑制了 A2780、SKOV-3及HO-8910细胞的增殖水平。通过平板克隆试验检测Morusin对于卵巢癌细胞克隆形成能力的影响,结果显示:当Morusin的作用浓度达到或超过20 μ M时,A2780、SKOV-3及H0-8910细胞所形成的克隆数目均显著减少。2.Morusin 对 A2780、SKOV-3 和 HO-8910 细胞形态的影响:用 Morusin(30μM)处理A2780、SKOV-3和HO-8910细胞,然后在倒置显微镜下观察细胞形态的变化。镜下可见药物作用3h后细胞中开始出现广泛的胞质空泡化,并且空泡在6h内不断扩大融合。3.Morusin对A2780和SKOV-3细胞凋亡和坏死性凋亡的影响:首先应用Western blot检测Morusin处理不同时间后A2780和SKOV-3细胞中凋亡相关蛋白PARP、caspase-3/9及相应剪切片段的表达水平变化。结果显示,与凋亡阳性对照(TNF 50ng/mL+CHX 50μM,处理 24h)相比,cleaved PARP、cleaved caspase-3/9的表达均未出现明显增加。MTT试验结果显示,在Morusin处理之前进行泛caspase抑制剂Z-VAD-fmk或坏死性凋亡特异性抑制剂Necrostatin-1预处理并没有明显逆转Morusin导致的卵巢癌细胞死亡。A2780及SKOV-3细胞总DNA电泳图显示Morusin处理后的A2780和SKOV-3细胞并未出现细胞凋亡所特有的DNA ladder现象。结果表明,Morusin并未诱导卵巢癌细胞发生细胞凋亡或坏死性凋亡。4.Morusin对A2780和SKOV-3细胞自噬的调控:首先使用自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3转染A2780和SKOV-3细胞,来示踪自噬小体的形成以及降解。当用Morusin处理A2780和SKOV-3细胞后,可见LC3红色荧光光点和LC3绿色荧光光点均增多并聚集,合成图像中黄色光点居多,与自噬抑制剂氯喹处理后的图象类似,表明Morusin阻断了卵巢癌细胞中的自噬流。然后应用Western blot检测Morusin处理后A2780和SKOV-3细胞中自噬相关蛋白LC3、p62、CTSB和CTSD的表达。结果显示,Morusin处理后A2780及SKOV-3细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高,并且呈现浓度与时间依赖性,而p62的表达水平在6h时是降低的,但12h之后又显著升高,表明Morusin在作用早期(6h之内)可能诱导了卵巢癌细胞自噬的发生但是在晚期(12h之后)阻碍了自噬流的进一步活化。除此以外,Morusin作用于A2780和SKOV-3细胞后引起酶原形式的CTSB和CTSD水平升高,活化形式的CTSB与CTSD水平降低,并均呈现浓度与时间依赖性,表明Morusin有可能是通过抑制溶酶体酶的活性来阻断自噬流。MTT试验结果显示,3-MA或CQ预处理不仅没有逆转Morusin造成的A2780和SKOV-3细胞存活率降低,还轻微增加了 Morusin的细胞毒性,表明Morusin可能在卵巢癌细胞中诱导了保护性的自噬。此外,3-MA或CQ预处理3h也并未逆转Morusin处理A2780和SKOV-3细胞6h后造成的广泛胞质空泡化的形态学改变,且Morusin(30 μM)处理6h后A2780和SKOV-3细胞的透射电镜图像中只观察到了极少量的吞噬泡与自噬小体,未见自噬溶酶体,说明Morusin诱导的卵巢癌细胞空泡化并非由自噬小体或自噬溶酶体堆积所引起。研究结论:1.Morusin可降低卵巢癌细胞的存活率、抑制其克隆形成能力及增殖水平。2.Morusin诱导卵巢癌细胞死亡并非通过凋亡、坏死性凋亡或自噬性死亡途径。第二部分Morus i n诱导卵巢癌细胞发生副凋亡及其机制研究研究目的:1.探究Morusin诱导卵巢癌细胞死亡的方式。2.探讨Morusin诱导卵巢癌细胞发生副凋亡的作用机制。研究方法:应用内质网红色荧光探针和线粒体绿色荧光探针标记检测Morusin作用后卵巢癌细胞A2780和SKOV-3中内质网和线粒体的形态和分布变化;应用透射电子显微镜技术检测Morusin作用后A2780及SKOV-3细胞中超微结构的变化情况;应用Western blot试验检测A2780和SKOV-3细胞中副凋亡抑制蛋白Alix以及内质网应激标记蛋白BiP、CHOP、IRE1 α和p-eIF2 α的表达;应用流式细胞术检测细胞内及线粒体内钙离子浓度、活性氧生成水平以及线粒体膜势能变化;应用JC-1染色和倒置荧光显微镜观察Morusin对卵巢癌细胞线粒体膜势能的影响;应用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)清除A2780和SKOV-3细胞内活性氧,应用DIDS抑制钙离子通过电压依赖性离子通道流入线粒体,应用BAPTA抑制钙离子流入细胞内;应用MTT试验检测DIDS或BAPTA预处理对Morusin作用后的A2780及SKOV-3细胞的存活率的影响。研究结果:1.Morusin对A2780和SKOV-3细胞中内质网和线粒体形态的影响:首先应用内质网红色荧光探针和线粒体绿色荧光探针标记检测Morusin作用后卵巢癌细胞A2780和SKOV-3中胞质内空泡的来源,结果显示:Morusin诱导卵巢癌细胞中产生的空泡部分与内质网红色荧光标记重合,部分与线粒体绿色荧光标记重合,表明Morusin诱导卵巢癌细胞产生的胞质内空泡来源于内质网和线粒体。然后应用透射电子显微镜技术检测Morusin作用后A2780及SKOV-3细胞中超微结构的变化情况,结果显示:Morusin作用后的卵巢癌细胞中出现了明显的线粒体和内质网的肿胀。2.Morusin对A2780和SKOV-3细胞中副凋亡抑制蛋白Alix和内质网应激标记蛋白表达的影响:应用Western blot检测A2780和SKOV-3细胞中副凋亡抑制蛋白Alix以及内质网应激标记蛋白BiP、CHOP、IRE1 α和p-eIF2α的表达,结果显示:Morusin作用于A2780和SKOV-3细胞后引起Alix表达水平降低,BiP、CHOP、IRE1α和p-eIF2α表达水平明显升高,并均呈现浓度与时间依赖性,表明Morusin诱导卵巢癌细胞发生了副凋亡和内质网应激。3.Morusin对A2780和SKOV-3细胞内及线粒体内钙离子浓度、活性氧生成水平及线粒体膜势能的影响:应用流式细胞术检测A2780和SKOV-3细胞内和线粒体内钙离子浓度以及细胞内活性氧生成水平的影响,结果显示:Morusin处理后仅轻微增加了卵巢癌细胞内的钙离子浓度,但显著增加了线粒体内钙离子浓度及细胞内活性氧累积。同时流式细胞术结果和倒置荧光显微镜观察细胞JC-1染色结果都显示Morusin明显降低了卵巢癌细胞A2780和SKOV-3的线粒体膜势能。4.Morusin诱导A2780和SKOV-3细胞发生副凋亡的机制研究:流式细胞术结果显示电压依赖性离子通道(VDAC)阻断剂DIDS预处理显著减弱了 Morusin所引起的A2780和SKOV-3细胞的线粒体钙超载。MTT试验结果显示DIDS预处理明显逆转了 Morusin所造成的卵巢癌细胞存活率降低,而钙离子螯合剂BAPTA并不能逆转Morusin导致的卵巢癌细胞死亡,表明Morusin诱导的卵巢癌细胞存活率下降是由线粒体内钙离子浓度升高引起的,而并非胞质内钙离子浓度升高。EdU掺入法结果显示DIDS并不能逆转Morusin导致的A2780及SKOV-3细胞增殖能力减弱,表明Morusin诱导的线粒体钙超载主要造成了卵巢癌细胞的死亡,而并非对其增殖能力产生影响。此外,DIDS预处理逆转了 Morusin所诱导的卵巢癌细胞广泛的胞质空泡化。Western blot结果显示DIDS也在一定程度上逆转了Morusin作用后A2780和SKOV-3细胞内质网应激标记蛋白、LC3Ⅱ、p62升高的表达水平以及Alix降低的表达水平。结果表明Morusin诱导的副凋亡与钙离子经VDAC内流入线粒体以及线粒体钙超载有关,但与胞质内钙离子水平升高不相关。5.Morusin诱导A2780和SKOV-3细胞活性氧水平升高和线粒体膜势能降低的机制研究:应用流式细胞术检测A2780和SKOV-3细胞线粒体内钙离子浓度、细胞内活性氧生成水平以及线粒体膜势能变化,结果显示:DIDS预处理可以在一定程度上逆转Morusin诱导的卵巢癌细胞活性氧水平升高及线粒体膜势能下降,但应用抗氧化剂NAC并不能逆转Morusin导致的卵巢癌细胞线粒体钙超载,表明Morusin诱导的卵巢癌细胞活性氧水平升高和线粒体膜势能降低是由线粒体钙超载引起的。研究结论:1..Morusin可诱导卵巢癌细胞发生副凋亡。2.Morusin通过VDAC介导的线粒体钙离子内流及钙超载导致线粒体功能障碍,进而诱导卵巢癌细胞的副凋亡。第三部分Morusin对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用及机制研究研究目的:1.构建人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,探讨Morusin对荷瘤裸鼠的体内抗瘤效应。2.探究Morusin发挥体内抗瘤效应的作用机制。研究方法:通过皮下注射SKOV-3细胞悬液,在裸鼠腋下形成移植瘤,建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型;将全部荷瘤成功的裸鼠随机分为对照组、DIDS单药组、Morusin单药组、Morusin和DIDS联合给药组四个组别;使用游标卡尺每三日测量一次各组皮下移植瘤的长短径并计算肿瘤体积;使用电子秤每三日测量一次各组裸鼠体重;连续给药21天后处死各组裸鼠,取出皮下移植瘤并拍照、称重;将瘤块切取部分制作成石蜡切片,采用免疫组织化学染色法检测组织中内质网应激标记蛋白BiP、CHOP的表达水平。研究结果:1.卵巢癌SKOV-3细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立:SKOV-3细胞接种至裸鼠皮下约18天时,接种部位可触及米粒大小结节,质韧,成瘤率100%。荷瘤裸鼠的一般状况良好,皮下移植瘤生长迅速,至接种28天左右时肿瘤平均体积达到100mm3左右,进行随机分组开始药物腹腔注射。在注射药物21天期间,各组裸鼠对药物耐受良好,未出现明显副作用和不良反应。2.Morusin对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响:肿瘤生长曲线显示,自给药第12天开始,Morusin单药组的皮下移植瘤的生长明显受到抑制,给药结束时平均肿瘤体积显著小于对照组。给药结束后瘤块称重结果显示Morusin单药组的平均肿瘤重量明显低于对照组的瘤重。但Morusin单药组的裸鼠体重与对照组相比无显著差异,表明Morusin对裸鼠正常生理状态无明显影响。3.Morusin对荷瘤裸鼠发挥体内抗瘤效应的机制研究:肿瘤生长曲线显示,DIDS单药组的平均肿瘤体积与对照组相比无明显差异,而自给药第15天开始直至给药结束,Morusin和DIDS联合给药组的平均肿瘤体积明显大于Morusin单药组。给药结束后瘤块称重结果显示Morusin和DIDS联合给药组的平均肿瘤重量明显高于Morusin单药组的瘤重,表明Morusin通过诱导卵巢癌细胞内线粒体钙超载来发挥体内抗瘤效应。DIDS单药组以及Morusin和DIDS联合给药组的裸鼠体重与对照组相比均无显著差异。免疫组织化学染色结果显示Morusin单药组的肿瘤组织中BiP和CHOP的表达水平显著高于对照组,而Morusin和DIDS联合给药组中BiP和CHOP的表达水平显著低于Morusin单药组,表明Morusin可以通过打破细胞内钙离子稳态来诱导荷瘤裸鼠体内的卵巢癌细胞发生内质网应激。研究结论:1.Morusin对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长有抑制作用。2.Morusin通过诱导卵巢癌细胞内线粒体钙超载来发挥在荷瘤裸鼠体内的抗瘤效应并引发卵巢癌细胞内质网应激。