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登革(dengue, DEN)病毒是黄病毒属的单股正链RNA病毒,根据E蛋白的抗原性不同,分为DEN-1,DEN-2,DEN-3和DEN-4 四个血清型。病毒基因组约含11000个核苷酸,编码三种结构蛋白和七种非结构(nonstructural, NS)蛋白, 其顺序依次为:5′-C-PreM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3- NS4a-NS4b-NS5-3′,DEN病毒是以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介,引起登革热(classical dengue fever, DF)和登革出血热/登革休克综合症(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome, DHF/DSS)的病原体。世界卫生组织(World Health Organization, WHO)报道,每年全世界热带与亚热带地区有1亿人感染DEN病毒,其中以与我国接壤的东南亚地区流行最为严重。近年来,我国南方频发DEN病毒的小流行,仅2002年广州和澳门地区就有近万人感染。因而,DEN病毒感染是一个严重的公共卫生问题。DHF/DSS表现为高热、出血、休克、病死率较高,但其发生机制不明,多数学者认为DHF/DSS的发生受病毒本身的生物特性和宿主(病人)的免疫因素两方面的影响。近年来,随着人口流动的增加,城市化的发展,DEN病毒型别的地域性分布被破坏,DF的流行区域扩大,DHF/DSS病例亦有增多趋势。有学者认为在一个地区不同血清型或同一血清型中不同基因型的DEN病毒流行可能是DHF/DSS发生的重要原因之一。因此了解流行区DEN病毒毒株的生物学特性及其传播规律,对于阐明DHF/DSS的发病机制,预防DEN病毒感染可能具有重要意义。目前利用DEN病毒的基因序列特征可以鉴定同一血清型中的DEN病毒基因型的差异,并根据这些差异分析流行毒株的来源。研究结果表明:根据小片段的基因序列分析所构建的进化树,与整个基因组比较,除在末端分支处有些较小的分歧外,所得结果基本一致。由于小片段基因序列分析简便易行,因而得到广泛的应用。本实验采集2002年9月就诊于广州市传染病医院的可疑DF病人(年龄在23～57本课题为国家自然科学基金项目30170848和30300303资助<WP=10>岁,性别12男,8女)的血清20份。采血时间为发热16hr至11天不等,采血后当天分离血清后冷藏带回,-70℃保存。首先将可疑病人血清稀释10倍后接种至C6/36单层细胞,每孔0.3ml,28℃孵育1hr后去除病人血清,加入含2% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI 1640培养液继续培养。 出现细胞病变(cytopathic effect, CPE)后收集培养上清,抽提病毒RNA,进行逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)。如接种后第7天未出现明显CPE,将细胞吹散后盲传,盲传6代后不出现CPE者视为阴性。在20份患者发病早期的血清标本中,有5份在感染C6/36后,出现明显的CPE,主要表现为细胞堆积融合,并出现空泡、网状结构。CPE一般在接种后5天出现,此后随着时间的延长,数量不等的细胞死亡,从培养瓶底脱落。用聚乙二醇(PEG)8000浓缩上述出现CPE 的培养上清,并用ISOGEN(Nippon Gene, Toyama,日本)抽提病毒RNA。同时合成DEN病毒四个血清型的通用引物,5′-GTG CAC ACA TGG ACA GAA CA-3′;下游引物:5′-CTT TCT ATC CAA TAA CCC AT-3′。扩增基因序列位于整个基因组2503～3041位,编码NS1蛋白的部分序列,长度为539nt(nucleotide)。进行RT-PCR后,将扩增产物克隆到T载体进行序列测定和比对以确定病毒的血清型。5份病毒分离阳性标本的感染上清均扩增出分布在500～750nt之间的特异条带,与预计的长度为539nt的目的片段相符。测序后比对结果表明:5份阳性标本NS1片段仅有个别核苷酸不同,可能是测序过程中的误差,故认为这5份病毒标本是同一株病毒。将序列输入GenBank进行Blast (Basic Local Alignment Search Tool)检索,结果与DEN-1病毒减毒株rDEN1delta30株同源性最高,为95%。故认为该毒株血清型为DEN-1,称为DEN-1/GZ2002株。进一步扩增在病毒进化上有代表意义的病毒血清型特异性E/NS1连接区基因片段。根据Blast结果,以GenBank上与所分离的病毒NS1片段同源性最高的DEN-1病毒 AY145123株为模板设计DEN-1病毒特异性引物,上游引物:5′-GTT CAA GAA GGG AAG CAG TA-3′;下游引物:5′-ACT GAC ATC TCC TAC GAC CA-3′。扩增基因序列位于整个基因组2107～2701位,是编码E/NS1连接区的序列,长度为595nt。RT-PCR法扩增出分布在500～750nt之间的特异条带,与预计的长度为595nt目的片段相符。序列测定证实片段长度为593nt,与rDEN-1delta30(AY145123)株相应序列相差的2nt可能由于缺失突变引起。选择其中的240nt(2282～2521)的片段与国际标准株和其他国内分离株进行比对。结果发现本次流行的A1630株与分离自澳大利亚的TI4株同源性最高,达98%。后者是基因型为IV型的DEN-1病毒,故认为本实验分离的<WP=11>DEN-1/GZ2002株,基因型为IV型。应用邻位相连法(Neighbor-joining method,NJ)构建E/NS1(240nt)序列和NS1(480nt)序列系统发生树,两个系统发生树结果基本一致,11株DEN-1病毒大体可分为3大群,与Rico-Hesse 1990分型中的I, IV 和V型以及Ana P. Goncalvez 2002年分型中的亚洲型,南太平洋型和美洲/非洲型分别相符。本实验所分离的DEN-1/GZ2002株与我国的GD23/95株(1995年广东流行株)亲缘关系较近,同属于基因型IV型或者称南太平洋型。通过乳鼠脑内接种及Ver