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增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）是孔源性视网膜脱离或严重眼外伤的严重并发症,且预后较差。PVR是视网膜脱离（retinal detachment,RD）复位手术失败的主要原因,发生于视网膜神经上皮层前、后面及玻璃体后表面形成的一层纤维细胞组织膜,膜的增生、收缩形成视网膜的固定皱褶,并发展为视网膜多种形式收缩、牵拉,其发病率为5-10%。增生性玻璃体视网膜病变实际上是一种组织损伤、修复反应的病理生理过程,其形成机制极为复杂。疾病的发病机制主要参与者视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial,RPE）的增殖和移行是发病的关键,整个病理机制由多种生物因子,细胞因子和炎症因子参与。RPE细胞在眼球发育和神经视网膜正常运作和维护中发挥着重要作用,它位于Bruch膜和视网膜中间,是一种高度分化的单层细胞。可以把营养物质从脉络膜运输到光感受器,吞噬脱落的光感受器外节,维持血-视网膜屏障等重要作用。当视网膜脱离发生后,血-视网膜屏障破坏,RPE细胞暴露在血清和玻璃体中。玻璃体中多种细胞因子刺激RPE细胞移行进入玻璃体腔内,进而增殖和转化,形成视网膜前增殖膜。此外,既往研究表明PVR患者玻璃体视网膜牵拉膜中存在细胞凋亡。细胞凋亡在某些眼科疾病的发展中起重要作用。在生长因子中,血小板衍生因子（PDGF）包括:PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD,通过二硫键形成同型或异型二聚体（PDGF-AA,-BB,-AB,-CC,和-DD）。PDGF参与细胞分化、增殖、凋亡和移行等多种重要的生物学活动。在眼科学研究表明,PDGF增强了成纤维细胞和RPE细胞的收缩。各项体内研究中发现,PVR患者及动物模型的玻璃体中均能检测出PDGF含量增多,在做了激光手术后的视网膜脱离患者和PVR小鼠模型的RPE细胞中,检测出PDGF表达是提高的。PDGF-BB作用于血管细胞、RPE细胞和神经胶质细胞的增殖和迁移,而PDGF-AA作用于非血管细胞的增殖和迁移。藏红花酸,藏红花的提取物之一,是一种类胡萝卜素物质,已被证明有多种生物学功能,如对多种细胞有抗增殖,抗炎等作用。在我们之前的研究中已经证实藏红花酸对ARPE-19细胞的增殖、迁移及间质转化有抑制作用。在本次研究,我们在体外试验中为ARPE-19细胞提供稳定的病理环境即加入稳定剂量的PDGF-BB,研究藏红花酸对PDGF-BB诱导下ARPE-19细胞作用及机制,在体内试验中拟以兔眼PVR模型为研究对象,在体内和体外两个层面加以研究。第一部分藏红花酸对体外培养的ARPE-19细胞在PDGF-BB诱导下的增殖,迁移及凋亡的影响及机制目的:本实验研究藏红花酸对体外培养的ARPE-19细胞在PDGF-BB诱导下的增殖,迁移和凋亡的影响及相关机制。方法:首先设置不同的药物浓度梯度（0μM,10μM,30μM,100μM,200μM,300μM,400μM,500μM和1000μM）,通过计算IC50筛选出实验中藏红花酸的作用浓度。将不同浓度的藏红花酸（0μM、100μM、200μM、400μM）和PDGF-BB作用于ARPE-19细胞,应用CCK-8实验检测藏红花酸对被PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞增殖的影响;用Ed U试剂盒进一步证明藏红花酸的抑制作用;用划痕实验和Transwell实验验证藏红花酸对PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞迁移的作用;用Annexin V-FITC/PI双标法流式细胞术检测藏红花酸对PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞凋亡的影响;用Western blot检测不同浓度的藏红花酸对PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞凋亡的相关蛋白Bax、Bak（促凋亡蛋白）和Bcl-2、Bcl-x L（抗凋亡蛋白）表达的影响。结果:低浓度的藏红花酸（100μM）的细胞增殖抑制率在72h时有明显的提高,而中浓度藏红花酸（200μM）和高浓度藏红花酸（400μM）干预后的细胞增殖抑制率升高呈浓度依赖和时间依赖性;被藏红花酸作用的细胞的Ed U转染概率比对照组降低了,且呈浓度依赖性,结果与CCK-8相符;划痕实验中,作用48小时和72小时,各种浓度的药物对细胞的迁移有明显抑制;Transwell实验结果分析,我们发现藏红花酸对细胞迁移的抑制作用呈浓度依赖;Annexin V-FITC/PI双标法流式细胞术检测发现藏红花酸诱导了PDGF-BB介导的ARPE-19细胞的凋亡,且随浓度的增加促进细胞凋亡的能力越强;western blot蛋白检测藏红花酸能够显著的抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x L的表达（P<0.01）,并且增加了促凋亡蛋白Bax、Bak的表达（P<0.01）,均呈浓度依赖性。小结:藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞的增殖和迁移,并且诱导PDGF-BB介导的ARPE-19细胞的凋亡。第二部分藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的血小板衍生因子受体（PDGFR）磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活目的:验证藏红花酸可能参与的信号通路。方法:使用western blot蛋白检测不同浓度藏红花酸（0μM、100μM、200μM、400μM）对PDGF-BB诱导的PDGFR磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活的影响。结果:不同浓度的藏红花酸均能抑制PDGFRβ的磷酸化,且对下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活均有显著的抑制作用。小结:藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的血小板衍生因子受体（PDGFR）磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活。第三部分藏红花酸治疗兔眼玻璃体视网膜病变的实验研究目的:进一步检测藏红花酸对治疗兔眼玻璃体视网膜病变的相关研究。方法:选用20只成年色素兔,随机分为实验组和对照组,每组10只。实验组玻璃体腔内注射2×105cells/0.1ml DMEM/F12的ARPE-19细胞悬液、2.5μl 20μg/m L的PDGF-BB、0.4μmol藏红花酸,对照组玻璃体腔注射ARPE-19细胞、2.5μl 20μg/m L的PDGF-BB、0.1ml PBS（含2%DMSO）。于3天、7天、14天及28天对其进行裂隙灯和眼底镜检查。于7天、14天及28天行暗适应视网膜电图检查和OCT检查,第28天处死实验兔取眼球标本作组织学检测,检测指标为p-AKT、p-p38、p-PI3K、p-ERK和p-JNK。结果:各组实验动物眼底情况在不同的时间点根据Fastenberg分级并进行统计学分析。造模后第7天:对照组0级4只,1级3只,2级2只;实验组0级8只,1级1只。造模后第14天:对照组1级5只,2级3只,3级1只;实验组0级2只,1级6只,2级1只。造模后第28天:对照组2级1只,3级2只,4级3只,5级3只;实验组1级2只,2级5只,3级2只。眼底相和OCT显示:造模后第7天,对照组玻璃体混浊较实验组严重,可以观察到增殖膜,实验组玻璃体轻度混浊,视网膜结构正常。造模后第14天,对照组玻璃体混浊,可见灰白色纤维条索和增殖膜,髓线处视网膜有脱离,实验组玻璃体轻度混浊,可观察到增殖膜。造模后第28天,对照组可见广泛的视网膜皱褶和脱离,实验组可见增殖膜及牵拉导致的视网膜脱离。ERG检查结果:第7天注药后的眼睛b波振幅较对侧眼没有明显变化,14天和28天后注药的眼睛b波振幅较对侧眼轻度下降,而对照组在第14天和28天后b波振幅较对侧眼明显下降。组织病理学结果:HE染色对照组神经节细胞层水肿,内外核层细胞排列混乱,光感受器细胞外节丢失。实验组视网膜全层结构清晰,形态正常,视神经节细胞层、内外核层细胞排列整齐。p-Akt、p-ERK和p-JNK免疫组织化学染色,对照组视盘前和脱离的视网膜前增殖膜可见强表达,实验组的视盘前和脱离的视网膜前增殖膜可见较低表达。视网膜未见阳性染色。p-PI3K和p-p38免疫组织化学染色,对照组视盘前和脱离的视网膜前增殖膜可见弱表达,实验组除了增殖膜中的血管管壁有阳性表达外,视盘前和视网膜前增殖膜均未见阳性染色,视网膜未见阳性染色。小结:藏红花酸抑制了兔PVR的发病进展,对视功能有保护作用,并且降低了视网膜增殖膜中p-Akt、p-PI3K、p-p38、p-ERK和p-JNK的表达。结论:1.红花酸抑制了PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞的增殖和迁移,并且诱导PDGF-BB介导的ARPE-19细胞的凋亡。2.藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的血小板衍生因子受体（PDGFR）磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活。3.藏红花酸抑制了兔PVR的发生进展,对视功能有保护作用,并且降低了视网膜增殖膜中p-Akt、p-PI3K、p-p38、p-ERK和p-JNK的表达。