论文部分内容阅读
目的:通过动物实验,研究维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate,VES;α-tocopheryl succinate,α-TOS)对黑色素瘤细胞的增殖、分化、凋亡的影响。通过相关蛋白表达的变化,进一步探讨VES抑制黑色素瘤细胞生长的作用机制,从而为黑色素瘤治疗提供新的方法及相应的理论依据。方法:将40只雄性BALB/c小鼠随机分为5组,每组8只。将鼠黑色素瘤B16细胞悬液接种于各组小鼠右侧背部皮下,每只1×10~6个,建立小鼠黑色素瘤移植瘤模型。当多数小鼠荷瘤后开始给药,采用腹腔注射给药方式:实验组分别给予VES 12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg腹腔注射,每天一次,连续五天,休两天,共两周;对照组给予芝麻油0.05ml/只,给药方法及时间同实验组;阳性对照组给予达卡巴嗪(Dacarbazine, DTIC)0.2ml (80mg/kg)腹腔注射,每天一次,连续五天。两周后,颈椎脱臼处死各组小鼠,剥瘤称重,计算抑瘤率;显微镜观察VES作用后的瘤细胞大体形态变化,透射电镜观察VES作用后的瘤细胞超微结构变化;流式细胞术检测各组瘤细胞周期分布及凋亡率;免疫组化法检测各组瘤细胞S-100,Survivin,Caspase-3的蛋白表达情况;运用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理,统计分析。结果:1 VES可抑制小鼠肿瘤生长:VES(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)各剂量组对小鼠B16移植瘤的抑制率分别为:13.72%、31.22%、45.58%,呈剂量依赖性。达卡巴嗪组抑瘤率为55.64%,高于VES各组。各组小鼠处死前的体重比较:VES各处理组与对照组相比,差异无统计学意义(p>0.05);阳性对照组体重有较明显下降,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(p <0.01)。2 VES可阻滞瘤细胞周期、诱导分化和凋亡:流式细胞分析仪检测结果显示VES12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg剂量组的细胞,S期比例逐渐增加,呈剂量相关性,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(p<0.05或p <0.01)。VES12.5mg/kg、25mg/kg剂量组瘤细胞的G0/G1期细胞比例逐渐增加,与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(p <0.05或p <0.01)。VES各剂量组瘤细胞的凋亡率分别为:20.88±0.58%、22.71±0.55 %、27.22±0.59%,阴性对照组为6.73±0.97%,均低于阳性对照组凋亡率30.95±0.52%,VES各组与对照组、阳性对照组相比,差异均有统计学意义(p <0.01)。3 VES对瘤组织细胞形态的影响:3.1经苏木精-伊红(HE)染色后,电子显微镜下观察细胞形态:阴性对照组瘤组织边界不清,细胞密集排列,异型性明显,而VES治疗组(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)瘤组织中心及边缘可见不同程度的片状或灶性坏死,黑色素颗粒释出,散布于细胞间。3.2透射电镜观察:在未经VES处理过的阴性对照组移植瘤B16细胞中,胞膜完整,细胞核大,不规则形,核质比大,常染色质丰富,异染色质较少,胞质中细胞器少,未见典型的黑色素小体;然而,经VES(12.5mg/kg、25mg/kg)作用后,细胞表面微绒毛减少,细胞核变小,核内异染色质增多,部分浓缩,核质比变小,可见大量典型的黑色素小体; 50mg/kgVES作用后,细胞出现不同程度凋亡改变:胞质中出现空泡,线粒体脊和膜部分或大部分融合消失,核膜局部向外呈泡状突起,核染色质高度浓缩,电子密度增高,边集于核膜下,形成新月体状,即凋亡细胞的特征性形态改变,凋亡半月,但无凋亡小体。4免疫组化检测瘤细胞S-100、Survivin、Caspase-3蛋白表达:按照IHS值法进行免疫组化评分。VES各组Survivin、S-100蛋白表达值(IHS值)随VES浓度增大而降低, Caspase-3蛋白表达值随VES浓度增大而升高。三种蛋白各自比较,VES处理组和阴性对照组,差异均有统计学意义(p <0.05或p <0.01)。且各治疗组Survivin的表达与Caspase-3、的表达呈负相关性(r_s=-0.705, p<0.01);与S-100的表达呈正相关(r_s=0.797, p<0.01)。结论:1 VES对鼠B16黑色素瘤移植瘤生长有显著的抑制作用,且呈一定的量效关系。2 VES有双重作用, 12.5mg/kg、25mg/kg VES可将细胞阻滞于G0/G1期,诱导部分恶性黑色素瘤细胞分化,透射电镜观察可见大量典型的黑色素小体。50mg/kgVES可以阻滞B16细胞周期于S期,诱导凋亡,抑制肿瘤增殖。3 VES具有抑制黑色素瘤增殖,致S-100表达减低,降低其恶性程度的作用。其机制可能是一方面下调Survivin蛋白,调节瘤细胞分化;另一方面启动Caspase-3依赖的凋亡途径。4 VES对鼠B16黑色素瘤移植瘤生长有较显著的抑制作用,低剂量诱导分化,高剂量诱导凋亡,为临床恶性黑色素瘤的治疗和化学药物预防提供了新的思路和理论依据。