论文部分内容阅读
肿瘤抗原OVA12是本实验室应用SEREX(Serological analysis of recombinant cDNA expression library)方法从人卵巢癌cDNA表达文库筛选得到的一个新的CT(cancer/testis)抗原。前期研究表明,OVA12抗原在多种肿瘤组织和肿瘤细胞株中高表达,在正常组织(睾丸除外)及正常细胞株中不表达或低表达;将OVA12基因转染SMMC-7721细胞后,细胞增殖速度加快,裸鼠体内成瘤能力增强。结果显示OVA12与肿瘤的发生发展存在密切的关联,因此对OVA12生物学功能和作用机制的深入研究有着重要的理论意义和临床应用价值。本课题主要从以下三个方面进行研究:1)从mRNA及蛋白水平检测多种正常和肿瘤细胞及组织中OVA12的表达水平,明确其表达谱特征;应用病毒感染的方式构建OVA12稳定高表达及干扰细胞株,通过体内外实验进一步探讨OVA12在肿瘤发生发展中的生物学功能。结果显示OVA12在多种肿瘤组织和细胞株中高表达,而在正常组织和细胞中不表达或低表达。体内外结果证实OVA12在肿瘤细胞株高表达或者干扰后能够显著促进或抑制肿瘤细胞增殖能力及抗凋亡能力,并能通过上调Mcl-1和survivin蛋白的表达增加肿瘤细胞对5-FU的耐药性;2)以OVA12稳定高表达和干扰细胞株为研究对象,检测与细胞增殖、凋亡密切相关的信号分子的表达变化。结果显示OVA12表达降低能够显著提高p53蛋白的表达,而OVA12高表达能够抑制p53蛋白的表达,但不影响p53 mRNA水平;与对照组相比,p53荧光素酶基因报告系统检测显示OVA12干扰细胞株p53转录活性明显增加,而OVA12高表达细胞株其转录活性显著降低。OVA12能够调控p53蛋白的K48位多聚泛素链形式,促进p53在蛋白酶体的泛素化降解,并能够影响肿瘤细胞对抗肿瘤药物顺铂(依赖p53信号通路诱导肿瘤细胞凋亡)的敏感性。结果提示OVA12蛋白能够负向调控p53蛋白;3)利用特异性的p53 shRNA干扰阻断p53信号通路,应用CCK-8等相关体内外实验方法检测p53蛋白表达降低后对OVA12生物学功能的影响,同时检测调控p53信号通路上游的多个重要蛋白表达变化,探讨OVA12调控p53信号通路的作用机制。结果显示与对照组相比,在OVA12干扰细胞株内,特异性阻断p53信号通路能有效的逆转OVA12表达降低所导致的细胞增殖能力降低、G1/S期阻滞等生物学行为,体内裸鼠成瘤实验与体外实验结果一致,证实OVA12发挥其生物学功能依赖于p53信号通路;OVA12能够影响肿瘤抑癌基因p14ARF的表达,促进MDM2从细胞核到细胞浆的输出,增强MDM2和p53的相互作用,加速p53蛋白的降解。上述一系列结果表明,OVA12蛋白是一种在肿瘤组织中呈特征性高表达的CT抗原,具有促进肿瘤细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用;提示OVA12通过负向调控p53信号通路作用机制发挥其生物学功能。