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[研究目的]核增殖因子Ki-67是一种肿瘤相关蛋白,发挥着癌基因作用,其功能与有丝分裂密切相关,在细胞增殖中是不可缺少,但其确切机制尚不清楚。文献报道,Ki-67与多种肿瘤的发生发展关系密切。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约22 nt的小分子非编码RNA,属于小RNA分子家族,能通过与3’非翻译区(3’UTR)靶位点互补结合,引起靶基因mRNA的降解或翻译抑制,从而发挥对靶基因表达的调控作用。miRNA的调节作用涵盖了生长发育、细胞凋亡、造血细胞分化、脂肪代谢等多种生命过程。近几年的研究表明,某些miRNA具有癌基因或抑癌基因活性,在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。但是Ki-67与miRNA的调控尚未见报道,本实验用肝癌作为实验模型,探寻miR-519d对Ki-67调控影响肝癌细胞生长的过程。从而阐明miR-519d对肝癌的发生、发展作用的可能。[研究方法]首先利用生物信息学方法筛选出靶定Ki-67的候选miRNA,并利用荧光报告载体实验验证Ki-67受miRNA的直接调控作用。再通过Real-time PCR和Western blot技术检测肝癌细胞和肝癌组织中内源性靶基因mRNA水平和蛋白水平的表达变化,进一步验证Ki-67受miRNA对其的调控作用。之后在人肝癌细胞系QGY-7703细胞中,过表达miRNA,利用MTT实验和细胞集落形成实验检测细胞生长活性及增殖能力的变化。然后应用Real-time PCR技术检测miRNA在人肝癌组织和癌旁正常组织中的差异表达。最后利用RNA干扰技术将Ki-67的表达沉默后,即构建质粒pSilenser/shRNA在细胞中进行转染,通过MTT实验、细胞集落形成实验和流式细胞术检测细胞生长的变化,进一步研究Ki-67的功能。[研究结果]利用生物信息学筛选出,miR-519d是靶定Ki-67的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)的候选 miRNA,其 3’UTR 包含 miR-519d 的潜在结合位点(见图1.1A)。荧光报告载体实验表明,miR-519d能够通过作用于Ki-673’UTR的特定位点,对其表达进行负性调节。在miR-519d过表达的肝癌细胞中,Ki-67 mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显下降,而在封闭miR-519d表达的肝癌细胞中,Ki-67 mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显升高。并且miR-519d表达低的肝癌组织中Ki-67 mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织。在肝癌细胞QGY-7703中,过表达miR-519d增强其功能后,细胞活性不受抑制,但集落形成能力明显降低。封闭miR-519d后,细胞活性亦不受抑制,且集落形成能力明显升高。说明miR519d对肝癌细胞长期生长的影响比较明显。Real-time PCR结果显示,miR-519d在人肝癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织。将Ki-67基因沉默以后,细胞增殖明显受到抑制,细胞集落形成能力明显降低。用流式细胞术检测,发现Ki-67加速QGY-7703细胞的G1期到S期的进程,与相关文献报道一致。用ASO-519d进行挽救实验,结果只能部分缓解G1期到S期的阻滞。[结论]在肝癌细胞中,Ki-67表达受到miR-519d负调控,可促进细胞增殖。通过本研究,进一步了解Ki-67对肿瘤的调节机制,使得我们对肿瘤的诊断和治疗提供新的依据。