原发性肝癌是危害我国国民健康的常见恶性肿瘤之一,在西方国家的发病率也呈上升趋势。全球每年有60-70万人死于肝癌,约55%发生在中国。手术治疗仍旧是肝癌最有效的治疗手段,术后高转移复发率已成为提高肝癌远期疗效的瓶颈。针对这一难题,学者们早期从肝癌细胞本身出发,发现了大量的癌细胞相关基因,并针对这些基因进行了靶向治疗,但均未取得满意的疗效。近年来逐渐重视从肿瘤微环境角度出发,探索各种免疫治疗手段,试图改变肿瘤免疫反应状态,从而探索治疗肿瘤的有效干预手段[1]。然而,由于许多问题没有阐明,目前尚无突破性进展。但对于部分患者而言,肝癌局部有效的免疫反应有助于改善临床进展,甚至提高患者生存率[2]。T淋巴细胞是肿瘤免疫微环境的重要组成部分,许多T细胞亚群在肿瘤免疫中的作用得到了深入研究与认识：细胞毒性T细胞及NKT细胞(Nature kill T cells;NK T cells)发挥抑癌免疫效应,辅助性T细胞向不同方向分化(如Thl、Th2、Th17、Treg细胞)也可发挥不同的免疫效应[3-5]。总体上,上述这些细胞均属于αβ细胞(T细胞受体双肽链由α链及β链构成),而与之相对应的γδT细胞(T细胞受体双肽链由γ链及δ链构成)由于在外周血中比例低(仅占成熟T细胞总数的5-10%),过去研究不受重视。然而,这群细胞在肝脏中特殊富集,可高达局部总T细胞总数的35%,在肝脏中发挥重要的免疫监视作用[6]。γδT细胞是一群兼有固有免疫、特异性免疫双重特征的T细胞,具有杀伤与调节双重功能,在局部免疫稳态的维持中发挥着不可替代的作用[7]。其主要免疫特点如下：1)T细胞受体(T-cell receptor;TCR)多态性有限,激活不依赖抗原递呈细胞,不受主要组织相容性抗原(major histocompatibility antigen；MHC)限制,因此最初被认为是固有免疫的重要组成部分；2)本身能发挥抗原递呈作用,为幼稚型αβT细胞的增殖、分化及活化提供共刺激信号,从而介导特异性免疫的诱导、活化[8]；3)在组织中可发挥免疫调节功能[7]。动物实验中表明γ6T细胞可通过直接杀瘤作用、早期大量分泌IFN-γ及抑制αβT细胞中的促癌细胞成分来抑制肿瘤的发生与进展[9]。体外实验证实,γ6T细胞能以TCR依赖/非依赖方式杀伤多种肿瘤细胞(结直肠癌[10]、肾细胞癌[11]、卵巢癌[12]、骨髓瘤[13])及肿瘤干细胞[14]。磷酸化抗原能有效地刺激γδT细胞增殖与活化,增强其杀伤肿瘤细胞的效率[14]。然而,这群细胞在肿瘤微环境中的免疫状态及与其他免疫细胞间的相互作用研究仍是一片空白。γ6T细胞是体内γ干扰素(Interferon-γ; IFN-γ)的重要来源[15]。IFN-γ通过促进异常细胞凋亡,参与肿瘤免疫监视[15,16],IFN-γ缺陷小鼠(IFN-γ受体缺失或IFN-γ信号转导关键分子STAT-1缺失)化学诱导肿瘤发病潜伏期明显缩短,发病率高于正常小鼠。然而,肿瘤细胞在IFN-γ的长期选择压力下发生免疫选择(Immunoselection),主要表现为被动改变自身免疫原性、通过IFN-γ信号通路相关调节分子变异等改变对IFN-γ的敏感性,从而实现肿瘤免疫逃逸。干扰素调节因子(Interferon regulatory factors; IRFs)是调节细胞内IFN-γ效应的重要转录因子,其中IRF-1介导典型的IFN-γ效应,而IRF-2能与IRF-1竞争DNA结合序列,从而为IRF-1提供负反馈抑制信号。肿瘤细胞内IRF-1、IRF-2的表达一定程度上反映了肿瘤细胞对内源性干扰素的敏感性。多项临床研究表明,肿瘤细胞内存在IRF-1表达缺失及IRF-2的过表达,且这一特征与肿瘤的恶性表型相关[17-19]。然而,两者在肝细胞癌中的表达特点及与肝癌生物学特性关系尚未阐明。本课题以肝细胞癌免疫微环境为主要研究对象,一、从γδT细胞入手,借助组织分离纯化淋巴细胞、流式细胞仪分析γδT细胞在肝癌局部的浸润及免疫状态,通过流式细胞仪或磁珠分选仪分选γδT细胞及调节性T细胞(Regulatory T cells; Treg细胞),采用共培养及相关免疫学方法分析Treg细胞对γδT细胞效应功能的抑制。我们发现,γδT细胞在外周血中比例较低,但在肝脏中大量浸润,而肝细胞癌中浸润却较癌旁肝组织中明显降低；肝细胞癌浸润性γδT细胞表现为功能抑制表型、杀伤功能明显减弱；肝细胞癌内γδT细胞与Treg细胞间明显负相关,Treg细胞通过转化生长因子β(transforming growth factor β, TGFβ)、白介素10(Interleukin10；IL-10)依赖途径抑制γδT细胞的杀伤功能。二、从固有免疫分子IFN-γ相关调节因子(干扰素调节因子[Interferon regulatory factor; IRF]1与IRF-2)出发,利用免疫组织化学染色、RNA干扰及相关的分子生物学探讨内源性IFN-γ在塑造肝细胞癌中的作用。我们发现肝细胞癌表达的IRF-1、IRF-2与肝癌预后相关,IRF-2/IRF-1比值可能通过影响STAT-3/MMP-9改变肝癌细胞的侵袭性。第一部分γδT细胞在肝癌患者不同部位中的分布与表型研究本研究旨在探索yδT细胞在肝细胞癌患者体内不同部位中(外周血循环、癌旁肝组织、肝癌病灶)的分布、亚群组成及免疫表型差异。通过不连续密度梯度离心法分离同一肝癌患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells; PBMCs)、癌旁浸润淋巴细胞(Peritumor infiltrating lymphocytes; PILs)及肝癌浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes; TILs),借助流式细胞技术分析不同部位γδT细胞分布、亚群组成(VδI+T细胞、Vδ2+T细胞)及免疫表型(免疫活化表型、成熟分化表型及激活型受体NKG2D)差异；利用免疫组织化学染色分析肝癌组织及癌旁组织中γδT细胞浸润特点及绝对计数变化。结果发现,γδT细胞在肝脏中浸润明显高于外周血,而在肝癌组织中的浸润较癌旁组织明显减少,减少的程度与肝癌病期正相关；免疫活化标志(CD86、CD83、CD80、HLA-DR、CD25)表达无明显差别；肝癌组织中yδT细胞表达激活型受体NKG2D较癌旁及外周血中显著减少；基于CD27、CD45RA的免疫效应细胞成熟表型分析显示肝癌内γδT细胞具有成熟表型的比例较癌旁明显减少；肝癌内yδT细胞亚群组成以Vδ1+T细胞为主,而癌旁肝组织中yδT细胞亚群组成以Vδ2+T细胞为主。免疫组织化学染色分析显示γδT细胞主要分布在实质细胞间隙浸润,肝癌组织内计数明显低于癌旁组织。本实验表明肝癌组织内γδT细胞浸润较癌旁组织明显减少,且减少程度与肝癌病期正相关。肝癌内γδT细胞存在成熟分化障碍及激活型受体表达抑制,提示其杀伤功能可能受到抑制。第二部分γδT细胞在肝癌患者不同部位中杀伤功能研究本研究旨在明确γδT细胞在肝细胞癌患者体内不同部位中(外周血、癌旁肝组织、肝癌病灶)的杀伤功能差异。通过不连续密度梯度分离同一肝癌病人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells; PBMCs)、癌旁浸润淋巴细胞(Peritumor infiltrating lymphocytes; PILs)及肝癌浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes; TILs),借助流式细胞仪分析同一肝癌患者不同部位γδT细胞表达穿孔素、颗粒酶、脱颗粒水平及IFN-γ分泌差异；借助免疫磁珠技术,分离纯化肝癌组织、癌旁组织中浸润的γδT细胞,通过流式细胞为基础的体外杀伤实验检测γδT细胞体外杀伤肝癌细胞系水平差异；通过ELISPOT技术检测分离纯化后的γδT细胞在非特异性及特异性刺激下分泌IFN-y差异；通过分离纯化肝癌组织、癌旁组织中浸润的γδT细胞,采用全基因组芯片技术分析其表达谱差异。结果发现肝癌浸润性γδT细胞虽然表达Perforin及Granzyme B水平与癌旁浸润性γδT细胞相比无差异,但在非特异性刺激(PMA+Ionomycin)下表达CD107a明显减弱,表明肝癌浸润性γδT细胞存在脱颗粒障碍；肝癌浸润性γδT细胞在非特异性刺激(PMA+Ionomycin)下表达IFN-γ显著减少；肝癌浸润性γδT体外杀伤肝癌细胞系(HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L、PLC、HuH7、7721)的效率明显低于癌旁浸润性γδT细胞；肝癌浸润性γδT在肝癌细胞系刺激下分泌IFN-γ水平也较癌旁浸润性γδT细胞明显减少；全基因组表达谱分析发现,肝癌浸润性γδT细胞“自然杀伤性细胞通路(Natural killer cell mediated cytotoxicity)”、“T细胞受体通路(T cell receptor signalling pathway)”及“原发性免疫缺陷通路(Primary immunodeficiency)”受损,这与前面发现的体外杀伤功能降低相吻合。本实验表明,肝癌浸润性γδT细胞存在杀伤功能及IFN-γ分泌缺陷。第三部分调节性T细胞介导γδT细胞功能抑制的研究本研究旨在阐明肝癌微环境中调节性T细胞(Regulatory T cells; Treg细胞)对γδT细胞效应功能的抑制及其相关分子机制。利用流式淋巴细胞分离及流式细胞技术分析Treg细胞在肝癌患者不同部位中的分布情况,建立其与γδT细胞间的相关性；通过淋巴细胞分离及流式细胞仪分选获取肝癌组织中Treg细胞；免疫磁珠技术分离纯化癌旁组织中γδT细胞。Treg细胞与γδT细胞体外共培养后进行杀伤功能检测、IFN-γ分泌检测；共培养体系中加入抗体(抗TGFp、抗IL-10、抗CTLA-4抗体)阻断Treg细胞的抑制作用；体外杀伤功能检测及IFN-γ分泌检测体系中加入重组细胞因子(TGFβ、IL-10)模拟Treg细胞对γδT细胞效应功能的抑制作用。结果发现Treg细胞在肝癌组织内大量浸润,比例上与γδT细胞呈明显负相关；体外Treg细胞能显著抑制γδT细胞对肝癌细胞系的杀伤,同时下调γδT细胞激活型受体NKG2D表达及其在肝癌细胞刺激下的FN-γ分泌；抗CTLA-4中和抗体不能阻断Treg细胞的抑制功能；而抗TGFp、抗IL-10中和抗体能显著阻断Treg细胞的抑制功能,两者联合应用无明显协同作用；TGFp、IL-10重组细胞因子能有效模拟Treg细胞对γδT细胞的抑制效应,两者联合应用无明显协同作用。本研究表明Treg细胞通过TGFp、IL-10直接介导γδT细胞效应功能抑制。第四部分干扰素调节因子1/2表达与肝癌预后及侵袭性的相关研究干扰素调节因子(Interferon regulatory factor; IRF)1与IRF-2是介导干扰素信号转导的重要转录因子,其表达异常与肿瘤的发生发展有重要相关性。本研究旨在通过分析IRF-1、IRF-2与肝癌患者预后及肝癌生物学特性的相关性,探讨内源性IFN-γ在塑造肝细胞癌中的作用。通过免疫组织化学染色,分析IRF-1、IRF-2在332例肝细胞癌患者肝癌组织中的表达及其与肝癌患者预后、临床免疫特征间的关系,蛋白水平分析IRF-1、IRF-2在肝癌细胞系中的表达及其与肝癌细胞系侵袭潜能的相关性,通过干扰IRF-1、IRF-2在肝癌细胞系中的表达及相关的功能实验分析IRF-1、IRF-2影响肝癌细胞侵袭性的机制。结果发现IRF-1瘤内低表达与肝癌术后不良预后相关,而IRF-2相反,其瘤内高表达与肝癌术后不良预后相关；多因素分析显示IRF-2/IRF-1比值是肝癌预后的独立预测指标。通过检测IRF-1、IRF-2在高低转移潜能肝癌细胞系中表达,发现IRF-2/IRF-1比值高低与肝癌细胞侵袭性正相关。干扰实验表明IRF-2/IRF-1比值可能通过STAT-3影响MMP-9表达介导肝癌细胞侵袭性改变。本研究表明IRF-1与IRF-2在肝癌细胞内表达水平与肝癌患者预后及侵袭性相关,IRF-2/IRF-1比值可能通过STAT-3影响MMP-9表达介导肝癌细胞侵袭性改变。结论1γδT细胞在肝癌内浸润减少,减少程度与病期正相关；肝癌浸润性γδT细胞表现为功能抑制表型。2肝癌浸润性γδT细胞脱颗粒及IFN-γ分泌障碍,体外杀伤肝癌细胞系效率减低；基因芯片分析提示其“自然杀伤性细胞通路”、“T细胞受体通路”及“原发性免疫缺陷通路”受损。3肝癌内Treg细胞与γδT细胞比例上呈负相关,Treg细胞通过TGFp、IL-10直接介导γδT细胞效应功能抑制。4干扰素调节因子(Interferon regulatory factor; IRF)1与IRF-2在肝癌细胞内表达水平与肝癌患者预后及侵袭性相关,IRF-2/IRF-1比值可能通过STAT-3影响MMP-9表达介导肝癌细胞侵袭性改变。创新点1首次明确γδT细胞在肝癌内浸润减少,肿瘤浸润性γδT细胞呈现功能抑制表型及效应功能缺陷。2首次证实肝癌微环境中Treg细胞对γδT细胞效应功能的抑制,并阐明Treg细胞通过TGFp、IL-10直接介导这一效应。3首次明确肝癌细胞内IRF-1、IRF-2表达水平与肝癌患者预后相关,并提示IRF-2/IRF-1比值可能通过STAT-3影响MMP-9表达介导肝癌细胞侵袭性。