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乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒属病毒，它能入侵中枢神经系统，造成神经炎症反应，导致人和动物发病甚至死亡，是一种危害严重的人兽共患病病原。sRNA(Small RNA)是一类长度上为约18-30nt的调控性RNA分子，主要包括微小RNA(miRNA)、干扰小RNA(siRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、Piwi蛋白互作RNA(piRNA)等。sRNA几乎普遍存在于所有生命体中，并在细胞增殖、分化和凋亡、癌症以及病毒感染中起重要作用。但目前对乙型脑炎病毒sRNA的研究报道较少，病毒编码sRNA的功能及其在病毒与宿主相互联系中所起的作用尚不清楚，因此研究JEV来源的sRNA对深入理解其致病机制具有重要意义。本研究具体内容如下: 通过RT-PCR和IFA鉴定，利用BHK-21和C6/36细胞从上海市嘉定区猪场蚊媒样品中成功分离出1株JEV，命名为JD-15株。该毒株源自中华按蚊，用JD-15株分别感染BHK-21和C6/36细胞，72h后所有细胞均发生明显病变，其病毒滴度为1.96×106PFU/0.1mL。用分离株JD-15脑内接种3周龄乳鼠，结果测得半数致死量(LD50)为4.2×101PFU/0.1mL，表明该毒株具有较强的神经毒力。对JD-15株的E基因进行克隆测序及进化分析，结果显示，该株JEV属于基因Ⅲ型，与减毒活疫苗株SA-14-14-2的E基因核苷酸序列的同源性为98.1％，氨基酸序列的同源性为97.5％。 用JEV感染鼠脑，提取总RNA进行深度测序，得到约31，543，891条小RNA序列，其中超过55000条序列可以匹配到乙脑病毒基因组，它们的长度多在19-24nt之间。为从测序结果中找到可能由JEV编码的sRNA，参考文献并利用RNAfold进行前体结构预测，由此筛选出四条候选的sRNA。为鉴定JEV编码的sRNA，用加尾法qRT-PCR检测感染5MOI JEV的BHK-21，PIEC和A549细胞的sRNA表达水平，结果发现有一条sRNA易检测到，而另外三条表达水平较低，因此将表达量较高的sRNA命名为JEV-32。随后建立了一种茎环法反转录的qRT-PCR方法，并用Northern blot试验一起进一步验证JEV-32在上述细胞中的表达。此外，研究了JEV-32的进化保守性，发现该分子高度保守，不限于特定的乙脑分离株，而是普遍存在于乙型脑炎病毒中。 为探究JEV-32的分子合成途径，将Drosha、DCR1和Ago2的siRNA和对照分别转染到A549细胞，转染24h后用0.01MOI JEV感染，感染后48h用茎环qRT-PCR检测JEV-32的表达量，结果显示Drosha、DCR1和Ago2均参与了JEV-32的生物合成。为探究JEV-32对乙型脑炎病毒复制的影响，向BHK-21细胞转染其类似物或对照及抑制物或对照，随后用JEV感染进行试验，结果表明JEV-32在病毒RNA复制中起促进作用。 本研究通过深度测序筛选了来源于JEV的小RNA，对其进行鉴定和功能分析，发现JEV编码的miRNA样小RNA——JEV-32对病毒复制具有正向调控作用，这为研究小RNA在病毒感染过程中发挥的作用及其对宿主影响的机制提供了科学基础。