论文部分内容阅读
背景与目的：目前，肺癌的发病率位居我国男性癌症首位。其中非小细胞肺癌约占肺癌的80%左右，传统的治疗方法，肺癌5年生存率仅15%左右。近年来NSCLC的分子靶向治疗药物，如吉非替尼和厄洛替尼等，因其针对性强，不良反应小，疗效确切被越来越多地应用于临床治疗中，然而分子靶向药物不能有效地清除病灶，后期往往会有耐药发生，导致肿瘤复发进展。因此，对分子靶向药物耐药机制的研究，已成为目前亟待解决的问题，也是我们课题组努力研究的方向。ABCG2，是ATP结合盒转运超家族成员之一，能够通过其外排泵作用促进细胞内药物主动外排，介导多种肿瘤耐药[1][2]。本课题组前期研究证实，A549获得性耐厄洛替尼细胞（A549/ER）相对于正常A549细胞ABCG2表达量明显升高。我们由此推测，厄洛替尼的耐药可能是由ABCG2介导，但具体机制尚不明了。PI3K/AKT信号通路是EGFR的下游，参与厄洛替尼的药物作用。磷醇酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phpsphatidylinositol3-kinase/serine-threonine kinase,PI3K/AKT)信号通路通过影响下游AKT的活化状态，参与并调节肿瘤发生发展的细胞生物学过程。因PI3K/AKT通路是厄洛替尼发挥作用的主要通路，所以我们认为ABCG2在NSCLC厄洛替尼耐药中起作用可能与PI3K/AKT信号通路调控有关。本研究采用MTT、Real-time RT-PCR及western-blot方法初步探讨A549及A549/ER细胞中ABCG2表达与PI3K/AKT信号通路的调控关系，并在此基础上使用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002和PI3K/AKT信号通路激活剂IGF-1进一步探讨ABCG2在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药中的机制。材料和方法：1.厄洛替尼对肺腺癌细胞系A549及A549/ER的影响及机制研究：培养人NSCLC细胞株A549及A549/ER，加入1μmol/L、5μmol/L、25μmol/L厄洛替尼12、24、48h后，用MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide)检测细胞增殖。Real-time RT-PCR和western-blot检测Akt(serine-threonine protein kinase)和ABCG2(ATP-binding cassette G2)的表达。2. PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002对肺腺癌细胞系A549及A549/ER的影响：培养人NSCLC细胞株A549和A549/ER，加入20μmol/L LY294002抑制剂，MTT、Real-time RT-PCR和western-blot检测Akt和ABCG2表达。流式细胞仪检测药物处理48h后Rh123外排情况。3. IGF-1可以激活PI3K/AKT信号通路，我们用其激活信号通路并研究对肺腺癌细胞系A549及A549/ER细胞的影响：培养人NSCLC细胞株A549及A549/ER细胞，加入100ng/ml IGF-1抑制剂， MTT、Real-time RT-PCR和western-blot检测Akt和ABCG2表达。流式细胞仪检测药物处理48h后Rh123外排情况。结果：1.随着时间的延长和剂量的增加厄洛替尼对A549细胞增殖的抑制作用增强；同样时间剂量，12、24h时A549/ER细胞增殖不明显，但48h后A549/ER细胞增殖显著。厄洛替尼作用A549细胞后，相较于未加入厄洛替尼的细胞，ABCG2mRNA表达明显下调且p-AKT、ABCG2蛋白表达亦下调。同样时间、剂量的厄洛替尼作用A549/ER细胞后，A549/ER细胞中ABCG2mRNA表达及p-AKT、ABCG2蛋白表达上调。2. LY29400220μmol/L作用A549及A549/ER细胞后相较于未加抑制剂细胞，ABCG2mRNA及p-AKT、ABCG2蛋白表达明显下调，且流式细胞术检测结果显示A549及A549/ER细胞在加入LY294002后相较于未加抑制剂细胞Rh123外排减少。4. IGF-1100ng/ml作用A549及A549/ER细胞后相较于未加IGF-1细胞，ABCG2mRNA及p-AKT、ABCG2蛋白表达明显上调，且流式细胞术检测结果显示A549及A549/ER细胞在加入IGF-1后相较于未加IGF-1细胞Rh123外排增加。结论：1.我们发现厄洛替尼能够以剂量、时间依赖性的方式抑制A549细胞增殖，但在A549/ER细胞中，12、24h时A549/ER细胞增殖改变不明显，在48h时A549/ER细胞增殖明显，认为随着药物作用时间的延长，药物外排增加，细胞内药物浓度降低所致。并证实厄洛替尼对ABCG2基因及蛋白水平均有调节，且该调节与PI3K/AKT信号通路p-AKT磷酸化程度有关。2. PI3K/AKT抑制剂（LY294002）可以显著下调A549和A549/ER细胞中ABCG2基因和蛋白表达，且对于ABCG2的调节与其p-AKT水平降低呈正相关。并且LY294002可减少细胞中Rh123外排。3.PI3K/AKT信号通路激活剂（IGF-1）可以显著上调A549和A549/ER细胞中ABCG2基因和蛋白表达，且对于ABCG2的调节与p-AKT升高水平呈正相关。并且IGF-1可增加细胞中Rh123外排。