前言凋亡抑制蛋白（Inhibitor of Apoptosis Protein,IAP）能够抑制细胞内的凋亡作用,是与肿瘤发生、发展密切相关的一类重要的抗细胞凋亡因子。细胞凋亡是调节机体组织平衡的重要机制,其过程受到严密的控制。半胱天冬酶（Caspases）的级联激活是凋亡过程的执行环节,IAP家族蛋白是控制Caspases级联激活的主要因素之一。IAP家族成员通过与Caspases-3、-7、-9结合来抑制其介导的细胞凋亡。IAP也能通过非Caspases依赖的机制来抑制凋亡。膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,其发生率和死亡率均居泌尿系肿瘤的首位。膀胱癌突出的生物学特性是其高复发性,凡保留膀胱的各种手术治疗,术后2年内超过半数的病人要复发,复发时约16%—25%恶性程度有增加的趋势。因此准确的判断其恶性程度和预后在指导膀胱癌的治疗中有重要的作用。Livin基因是最新发现的IAP家族成员,它在大多数正常成人组织中不表达,而在一些肿瘤组织细胞中高表达,其异常高表达常引起组织细胞凋亡受阻,与肿瘤的发生密切相关。近年来,以Livin为靶点的肿瘤基因治疗策略倍受关注,可能成为肿瘤治疗的新靶点,为肿瘤治疗提供了新的研究方向。本实验旨在探讨Livin基因对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响及可能的作用机制。目的1、本研究通过检测膀胱癌标本中Livin表达情况,探讨其在膀胱移行细胞癌发生发展及预后判断中的作用;2、通过在膀胱癌细胞系中转染Livin基因,观察其对于膀胱癌细胞系增殖和凋亡的影响及机制;3、通过进行RNA干扰（RNA interference,RNAi）实验,研究小干扰RNA（smallinterference RNA,siRNA）对膀胱癌细胞恢复化疗敏感性的作用及机制。方法一、实验材料（一）主要试剂:人膀胱癌T-24细胞株购自中国典型培养物保藏中心;Lipofectamine^TM2000脂质体转染试剂、细胞总RNA提取试剂Trizol及真核表达载体pcDNA3.1（+）购自美国Invitrogen公司;去内毒素质粒提取试剂盒Wizard purefection plasmid DNApurification system购自德国Promega公司;RPMI1640培养基、G-418购自美国GIBCO公司;兔抗人Livin多克隆抗体购自美国Imgenex公司;异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔抗体购自美国Santa Cruz公司;丝裂霉素C（MMC）购自瑞士Roche公司;MTT与AO购自美国Amresco公司;二甲基亚枫（DMSO）、碘化丙啶（PI）及碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体购自美国Sigma公司;Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司;PCR引物、100bp DNA标准参照物、RT-PCR试剂盒、HindⅢ与BamHI核酸内切酶、pMD19-T载体、感受态菌JM109及Genefinder核酸染料购自日本TaKaRa生物有限公司;丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自美国Pharmacia公司;硝酸纤维素膜购自美国Bio-rad公司;针对livin序列特异的siRNA由上海吉玛公司设计并化学合成,其序列为正义链:5′-GGG ACC ACG UGG AUG GGC AdTdT-3′与反义链:5′-UGC CCA UCC ACGUGG UCC CdAdG-3′;此外阴性对照正义链序列为:5′-UUC UCC GAA CGU GUCACG UTT-3′,反义链为:5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′;GAPDH阳性对照正义链序列为:5′-GUA UGA CAA CAG CCU CAA GTT-3′,反义链为:5′-CUU GAG GCU GUU GUC AUA CTT-3′,额外设计的悬头dtdt,可以增加siRNA的稳定性;胎牛血清（FBS）购自TBD公司;常规试剂购自华美公司。（二）主要仪器:温育箱、Olympus光学显微镜、倒置显微镜、高压锅、深冻冰箱、普通冰箱、紫外/可见光光度计（DU-640,Beckman）、低温超速离心机（GS-15 Rbeckman）、冷冻切片机、紫外分光光度仪、组织匀浆机、超声粉碎机、转印仪、电泳仪、PCR扩增仪、自动电泳凝胶成像分析仪、自动酶联免疫检测仪、细胞培养箱等。二、实验方法（一）免疫荧光方法检测Livin蛋白表达:将各样本组织以组织包埋剂（OCT）包埋,冰冻切片机切成6μm厚切片,置于多聚赖氨酸处理过的载玻片上,以多聚甲醛固定20-30min,0.2%Triton-X100穿通10-15min,1:400兔抗人Livin多克隆抗体4℃孵育过夜,1:200 FITC标记的羊抗兔抗体室温孵育2h,上述操作过程中常规PBS洗涤,最后以50%甘油封片,荧光显微镜下观察。（二）Western blot方法检测Livin蛋白表达:先提取总蛋白,采用福林-酚法（lowry法）测定蛋白浓度后,煮沸变性5min后备用。取40ug蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳（4%浓缩胶,12%分离胶）后,以半干转膜法转至硝酸纤维素膜上,再以10%脱脂奶粉封闭,洗膜。兔抗人Livin多克隆抗体（1:200）孵育过夜,洗膜,1:2000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体孵育2h,之后放入碱性磷酸酶显色液中显色,Chemi Imager 5500电泳凝胶成像系统成像。同样步骤加入内参β-actin抗体,检测样品中β-actin的蛋白表达作为内参照。（三）RT-PCR方法检测Livin mRNA表达:Trizol法提取细胞总RNA,RT-PCR过程按照试剂盒说明进行操作;Livin的上游引物:5′-acc cag gag aga ggt cca gt-3′,下游引物:5′-cac tca gca cag acc agg tg-3′,扩增出长213bp的产物则为Livinα,如果扩增产物长159bp则为Livinβ表达;内参照GAPDH的上游引物:5′-acc aca gtc cat gcc arc ac-3′,下游引物:5′-tcc acc accctg ttg ctg ta-3′,全长452bp。Chemi Imager 5500电泳凝胶成像系统成像。（四）真核表达载体pcDNA3.1（+）-livin的构建:livin全长cDNA的目的片段通过RT-PCR方法获得,所得产物全长1297bp;将目的片段与pMD19-T载体进行TA克隆后,再转化感受态菌,挑选阳性克隆菌株进行DNA测序以确定正确的菌株,常规摇菌扩增;之后选取含有正确livincDNA的T载体及pcDNA3.1（+）的阳性菌提取质粒,分别应用HindⅢ与BamHI核酸内切酶双酶切进行定向克隆,从而获得了pcDNA3.1（+）-livin,转化至感受态菌,筛选并扩增后,酶切和DNA测序鉴定后,提取去内毒素质粒,-80℃深冻备用。（五）基因转染:按照Lipofectamin^TM2000转染试剂盒说明书进行操作,分别将pcDNA3.1（+）-livin与pcDNA3.1（+）转染入膀胱癌T24细胞中;在含有G418（400mg/L）的培养液中持续筛选3-4w,最终得到转染成功后稳定表达目的片段的抗药单克隆细胞株T24/livin⁺与T24/pcDNA3.1（+）;然后常规应用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。（六）RNA干扰:按照Lipofectamin^TM2000转染试剂盒说明书操作,分别转染终浓度为50nmol/1、100nmol/1、200nmol/1的siRNA,6小时后更换成于无抗生素的培养基,在37℃,5%CO₂培养箱内培养48小时,用MMC（48μmol/L）处理24h进行检测分析。每组实验进行3次,设立阴性及阳性对照组。在转染siRNA 6小时后,荧光显微镜下观测转染效率。后续实验选取转染效率高者进行。（七）克隆形成试验:在每个含10ml预温37℃培养液的培养皿中种植100个细胞,在37℃、5%CO₂及饱和湿度下静置培养2-3w后;弃去培养液,PBS小心浸洗2次,纯甲醇5ml固定15min,加适量吉姆萨染液染色30min;在显微镜下计数多于50个细胞的克隆数。克隆形成率（%）=（平均克隆数/接种细胞数）×100%。（八）MTT方法检测细胞抑制率:取对数生长期的膀胱癌细胞消化成单细胞悬液,以每孔1×10⁵的浓度接种于96孔板中,每孔加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液200μl,在37℃、5%CO₂及饱和湿度下静置培养;24h后更换为200μl无血清培养基,并加入磷酸盐缓冲液（PBS）配制的浓度为48μmol/L的MMC。实验每组设4个平行孔。作用24h后,每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl,37℃孵育4h。弃上清,加入DMSO 150μl,振荡10min溶解结晶,自动酶联免疫检测仪于490nm波长处测定吸光度值A₄₉₀,计算细胞抑制率:抑制率=(1—加药组A₄₉₀/对照组A₄₉₀)×100%。（九）AO荧光染色检测细胞凋亡:收集用MMC（48μmol/L）处理24h的转染前后的T24细胞,以PBS洗2次,制备单细胞悬液,调整细胞浓度为1×10⁷个/ml。取细胞悬液95μl加0.1g/L的AO工作液5μl混匀,取20μl滴于载玻片上,盖玻片封片后立即于570nm波长处在荧光显微镜下观察、拍照。（十）FCM检测细胞凋亡率:收集用MMC（48μmol/L）处理24h的转染前后的T24细胞,制备单细胞悬液,取8×10⁵个细胞,1000rpm,4℃离心10min,弃上清液,加入1ml冷PBS轻轻震荡,再次离心弃上清,重复2次,将细胞重悬于200μl结合缓冲液,加入10μl AnnexinV-FITC和5μl PI,混匀,室温下避光孵育15min,在每管中加入300μl结合缓冲液,1h内流式细胞仪检测。（十一）Caspase-3活性检测:应用Caspase-3/CPP32比色分析试剂盒（BioVision）检测Caspase-3活性。将膀胱癌细胞以每孔5×10⁶细胞接种于96孔板;用50μl预冷的细胞裂解缓冲液重悬细胞,冰上孵育10 min;以10,000xg离心1min后,将上清移入一新管中并置于冰上;检测蛋白浓度;对于每次检测均以50μl细胞裂解缓冲液稀释200μg蛋白;于每一份样本中均加入50μl 2×反应缓冲液（含有10 mM DTT）;再加入5μl的4mMDEVD-pNA底物于37℃避光孵育2h;最后以紫外分光光度计在405nm波长检测吸光度值A₄₀₅,以A₄₀₅值大小表示Caspase-3活性。（十二）统计分析:所得数据应用SPSS12.0统计软件进行统计分析,所得数据以（?）±s表示,采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。两样本率的比较用χ²检验,P＜0.05认为有统计学意义。三、实验结果（一）膀胱癌组织中Livin表达的检测15例非肿瘤膀胱组织Livin表达均为阴性;而在48例膀胱癌组织中有19例可见Livin表达,其意义明显:复发的膀胱癌组织中Livin阳性表达率（58.82%,10/17）明显高于初发的膀胱癌组织（29.03%,9/31）,差异有统计学意义（P＜0.05）;但Livin表达率在不同分级的肿瘤组织中无明显差异。两年随访发现:Livin表达阳性的肿瘤病人复发率高（13/19,68.42%）,与Livin表达阴性者的复发率（11/29,37.93%）相比差异有统计学意义（P＜0.05）。（二）真核表达载体pcDNA3.1（+）/Livin的构建人Livin cDNA全长897bp,定向连接至pcDNA3.1（+）的多克隆位点HindⅢ与BamHI,构建重组载体pcDNA3.1（+）/Livin。酶切鉴定及基因测序表明pcDNA3.1（+）/Livin构建成功。（三）转染效率的检测转染siRNA六小时后,荧光显微镜下观测发现:50nmol/1、100nmol/1、200nmol/1的siRNA干扰后,发荧光细胞占所有细胞的比率分别是67.5%,86.7%,73.6%,证实转染效率较高,故选择浓度为100nmol/1的siRNA干扰组进行后续实验。（四）转染Livin基因的检测Western blot检测结果显示:T24/livin⁺组于39kD处出现单一条带,在37kD处无蛋白条带出现,siRNA干扰组可见Livin蛋白表达水平明显减弱,约为前者的18%,而T24组未见Livin蛋白表达;RT-PCR方法检测结果显示:T24/livin⁺组细胞于213bp位置处扩增出单一产物,而在159bp处无mRNA产物条带出现;siRNA干扰实验组Livin mRNA表达显著减少,约为前者的17%;阴性对照组Livin mRNA表达水平与T24/livin⁺组相比未见显著减少;阳性对照组中可见GAPDH mRNA表达水平明显减少;而T24组未扩增出Livin mRNA产物。siRNA干扰后Livin表达水平较干扰前水平降低超过80%。（五）克隆形成试验T24/livin⁺组、siRNA干扰组与T24组的克隆形成率分别是（72.8±6.8）%,（47.5±4.2）%和（43.0±3.7）%。T24/livin⁺组与siRNA干扰组和T24组相比,克隆形成能力明显增加（P＜0.01）;siRNA干扰组与T24组的克隆形成能力没有显著差异（P＞0.05）。（六）MTT方法检测MMC对于T24/livin⁺组、siRNA干扰组和T24组细胞株的生长抑制率分别为（41.0±3.1）%,（69.9±5.2）%,（76.9±3.9）%,转染Livin的T24细胞与siRNA干扰组及非转染组相比增殖率明显升高其差异具有统计学意义（P＜0.01）;而siRNA干扰组和T24组的差异没有统计学意义（P＞0.05）。（七）细胞凋亡AO染色结果在MMC处理24h后,T24/livin⁺组呈现典型凋亡形态的细胞数量少,而siRNA干扰组和T24组凋亡细胞数量多,且凋亡形态学表现更加明显。（八）细胞凋亡率检测结果AnnexinV-FITC/PI双染法凋亡检测结果显示:在MMC处理24h后,T24/livin⁺,siRNA干扰组和T24组的凋亡率分别为（8.55±1.40）%,（18.65±1.58）%和（20.78±1.45）%。转染livin后的T24细胞系对于化疗药物的耐药性增强明显,差异具有统计学意义（P＜0.01）;而siRNA干扰后和未转染livin的T24细胞对于化疗药物的敏感性均较强,二者差异没有统计学意义（P＞0.05）。（九）Caspase-3活性检测结果以MMC处置24h后,caspase-3活性值在T24/livin⁺组,siRNA干扰组和T24组细胞中分别为0.1695±0.0105,0.4678±0.0474 and 0.4955±0.0283;与siRNA干扰组和T24组相比,T24/livin⁺肿瘤细胞中caspase-3活性显著地下降了（P＜0.01）;而在siRNA干扰组和T24组的细胞中caspase-3活性变化没有显著差异（P＞0.05）。四、结论膀胱移行细胞癌组织中有一定比率的Livin表达,在膀胱肿瘤患者中检测到Livin表达,可能提示该患者有早期复发倾向及高复发风险,应加强综合治疗和定期复诊,检测膀胱癌组织中Livin表达有望作为膀胱癌诊断的一种指标,在膀胱肿瘤的预后判断中起重要作用;基因转染法可以将livin高效、稳定的整合进人膀胱癌细胞株T24中,赋予肿瘤细胞在化疗中具有更强的抗凋亡能力,livin表达可能是膀胱癌抵抗化疗及术后高复发风险的征象;通过针对靶基因livin mRNA合成的siRNA,能够有效的抑制livin基因的表达,增强caspase-3激酶活性,诱导肿瘤细胞凋亡并显著提高膀胱癌细胞对化疗的敏感性,因此可以考虑把Livin作为膀胱癌诱导凋亡治疗中的一个很有前景的分子靶点;