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背景和目的 热休克蛋白gp96作为分子伴侣参与了肿瘤抗原向MHC-Ⅰ类分子途径的递呈过程,并与抗原肽形成gp96-肽复合物激活CD8~+T淋巴细胞,产生抗肿瘤的特异性免疫反应。因此,gp96-肽复合物疫苗为肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。但是,如此充满前景的疗法需要从有限的肿瘤组织中快速提取高纯度的gp96,传统的方法因为需要使用ConA-Sepharose柱,很容易造成ConA的污染,而ConA本身是一种T细胞丝裂原,可对疫苗接种者的免疫系统产生有害作用。所以,寻找一种快速有效而又高度特异性的方法分离纯化gp96,就成为该疫苗大规模临床应用所要解决的首要问题。噬菌体抗体库技术可有效地解决以上问题。我们利用噬菌体表面展示技术构建人天然Fab段噬菌体抗体库,建立人源抗体制备技术平台,为寻求恶性肿瘤的免疫治疗新方法打下基础。 方法 取4个健康献血员新鲜血液各200ml,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,设计多对引物,以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA。轻链PCR产物和噬粒载体pComb3经Sac Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,由T4 DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,扩增后提取噬粒,构建轻链库。轻链库和重链Fd段PCR产物经Xho Ⅰ和Spe Ⅰ酶切,以同样方法连接后转化XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13,产生噬菌体抗体全库。提取噬粒酶切鉴定轻链库和全库有无插入片段。分别以噬菌体全库和提取的噬粒为模板,以轻、重链不同引物组合进行PCR扩增。构建的抗体库用人血白蛋白、IL-2和gp96等不同蛋白进行3轮筛选。 结果 提取的淋巴细胞总RNA及逆转录合成的cDNA质量好,部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增。Fab全库库容达6.6×10~6,酶切和PCR显示有插入片段。用人血白蛋白、IL-2和gp96等不同蛋白进行几轮筛选,抗体库得到了不同程度的富集。