【摘 要】
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[目的]本研究采用阳离子表面活性剂、硅烷偶联剂和浸泡干燥三种方法表面处理制备部分脱蛋白骨（PDPB）,与Ⅰ型胶原制备得到PDPB/Ⅰ型胶原复合支架,并培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）接种于复合支架,探讨体外构建组织工程骨与细胞复合的最佳方法,为体内构建组织工程骨提供理论依据。[方法]①按文献方法制备PDPB,随机选择5块进行肉眼和扫描电镜观察;将PDPB随机分为3组,浸泡干燥法作为对照组,阳
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81760403,No.81960409）； 陈世益教授专家工作站项目（No.2018IC102）； 云南省骨关节疾病临床医学中心（ZX2019-03-04）； 云南省科技厅-昆明医科大学联合专项基金面上项目（201701UH00095）；
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[目的]本研究采用阳离子表面活性剂、硅烷偶联剂和浸泡干燥三种方法表面处理制备部分脱蛋白骨（PDPB）,与Ⅰ型胶原制备得到PDPB/Ⅰ型胶原复合支架,并培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）接种于复合支架,探讨体外构建组织工程骨与细胞复合的最佳方法,为体内构建组织工程骨提供理论依据。[方法]①按文献方法制备PDPB,随机选择5块进行肉眼和扫描电镜观察;将PDPB随机分为3组,浸泡干燥法作为对照组,阳离子表面活性剂与硅烷偶联剂为实验组,进行表面改性和修饰,与Ⅰ型胶原复合制备得到PDPB/Ⅰ型胶原复合支架,微量凯氏定氮法测定三种PDPB/Ⅰ型胶原复合支架的含氮量,万能生物力学测试仪检测材料的三点抗弯曲、抗压缩等力学指标;②抽取大鼠骨髓,分离、纯化BMSCs,进行体外培养、鉴定,并对其生物学特性进行研究;③将BMSCs接种到三种方法处理的PDPB/Ⅰ型胶原复合支架共同培养,采用流式测定法检测复合支架上BMSCs的增殖情况,扫描电镜下观察细胞在复合支架上的附着及生长情况。[结果]①所制备的PDPB肉眼呈白色,质地硬而脆,表面有大量孔隙相互连通,呈蜂窝状,扫描电镜下具有原始骨小梁与疏松网孔结构,孔壁光滑;三种方法制备的复合材料的含氮量均随时间而增加,其中硅烷偶联剂处理的复合材料的含氮量均显著高于其他两组（P<0.05）;三点抗弯曲与抗压缩实验中,硅烷偶联剂处理72h制备的PDPB/Ⅰ型胶原复合材料的屈服强度和最大应力值与其他两组相比,均为最高（P<0.05）;②原代培养BMSCs刚接种时,细胞呈圆形,胞体透亮,都没有贴壁,与周围的造血干细胞相互混杂,1～2天后部分细胞开始贴壁,3天后完全贴壁,细胞逐渐变成短梭形,与成纤维细胞类似,形态均一。5～6天后细胞形成集落状,由10～20个细胞组成,形态变为长梭形或多角形,细胞排列呈一定的方向性,围绕中心呈漩涡状。此后集落逐渐增多,并且集落中的细胞数量逐渐增多,并融合为单层。随之细胞大部分融合,长满瓶底;流式细胞术检测结果示CD29和CD90高表达,CD34和CD45不表达或表达极少;ALP染色可见大量细胞呈ALP阳性,细胞融合成一团,失去以前的生长方式,ALP阳性的黑色颗粒状影像相互融合成网状。钙化结节经茜素红钙染色呈桔红色,互相融合,形成大片钙化影;③扫描电镜观察显示BMSCs在材料孔隙内生长、分化增殖,细胞附着最佳的是硅烷偶联剂处理72小时制备的复合材料;流式细胞术检测硅烷偶联剂处理72小时制备的复合材料的BMSCs增值情况最佳（P<0.05）。[结论]①与阳离子表面活性剂和单纯浸泡干燥相比,硅烷偶联剂处理的PDPB更有利于Ⅰ型胶原的粘附,且制备的PDPB/Ⅰ型胶原复合材料的力学性能更为优异;②本实验分离出的细胞是BMSCs,且增殖稳定,适合作为骨组织工程种子细胞;③三种方法制备的PDPB/Ⅰ型胶原复合支架均不引起明显的细胞免疫反应,细胞相容性良好,其中最有利于细胞附着、增殖的是硅烷偶联剂处理制备的复合材料。
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