研究目的:红细胞是人体含量最丰富的细胞,在运输氧和二氧化碳方面发挥着重要功能。红细胞发育是一个复杂的多阶段过程,分为早期红系发育、红系终末分化和网织红细胞成熟三个阶段。在红细胞发育分化过程中,发生了一系列变化,包括细胞体积减小、染色质凝缩、膜结构重排、细胞器消失和脱核等。溶酶体是由单层膜围绕内含多种酸性水解酶的细胞器,在消除无用的生物大分子和衰老的细胞器等方面发挥着重要的作用,并且还参与分泌、质膜修复、信号传递、细胞稳态、能量代谢等生物过程。溶酶体中含有60多种水解酶,三肽基肽酶1(Tripeptidyl Peptidase 1,TPP1),是其中的一种丝氨酸羧基溶酶体蛋白酶。TPP1是迄今为止在哺乳动物细胞的溶酶体中鉴定出的唯一具有三肽基肽酶活性的水解酶。本课题通过对红系发育进程中的动态转录谱进行比对分析,发现在红系终末分化阶段TPP1的表达急剧升高,推测TPP1在红系发育终末阶段起到重要作用。为深入探索TPP1在红系发育过程中的作用,我们利用基于sh RNA的策略在脐带血来源的CD34~+细胞中敲低TPP1的表达,诱导定向红系发育分化,检测发育进程中细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和脱核等重要生物学事件的异常,综合利用多组学研究,结合基因功能研究方法探究TPP1调控红系发育的作用机制。通过本课题的研究,有望阐明TPP1在红系发育进程中的调控作用,不仅能为构建红系发育终末阶段调控网络提供重要帮助,并可为红系发育调控机制研究提供重要的数据支撑。研究方法:1.体外造血干细胞定向红系发育体系中敲低TPP1的表达。构建sh RNA敲低型载体,利用慢病毒转染的方式,分别转染脐带血来源的CD34~+造血干细胞和K562细胞系,以嘌呤霉素筛选后,综合利用q RT-PCR技术和Western Blotting技术检测TPP1的敲低效率。2.检测敲低TPP1对红系发育过程中细胞增殖、分化、凋亡及脱核等生物学事件的影响。在脐带血来源的CD34~+细胞中敲低TPP1的表达并诱导定向红系发育,利用流式细胞术,通过检测GPA、IL-3R、CD34和CD36表面标记,比较TPP1敲低组与正常组早期祖细胞分化的区别;同时在红系终末分化过程中利用细胞计数法检测细胞增殖情况;利用流式细胞术,通过GPA、α4-integrin、Band 3表面标记分析细胞的终末分化情况;Annexin V抗体孵育细胞,利用流式细胞术检测细胞凋亡情况;利用Hoechst 33342细胞核染料,通过流式细胞术检测细胞脱核;利用MGG染色观察细胞形态。同时,K562细胞系中敲低TPP1的表达,利用Hemin诱导K562细胞向红系分化过程中,连续计数4天检测细胞增殖情况,利用Annexin V标记凋亡细胞,利用流式细胞术检测TPP1敲低组与正常组细胞凋亡情况,通过联苯胺染色的方法检测细胞的分化情况。3.对TPP1表达缺失的细胞进行转录组测序和蛋白质组测序,并利用生物信息学方法分析,探究TPP1表达缺失涉及的相关机制。利用转录组测序技术分析TPP1敲低组与正常组的差异基因,对差异表达基因进行聚类分析、GO功能注释和富集分析。利用蛋白质组测序技术检测TPP1敲低组与正常组差异表达的蛋白,试图探索红系发育过程中累积的TPP1降解底物,并且结合转录组测序结果探究TPP1敲低导致的细胞凋亡发生的相关机制。4.检测TPP1表达缺失时溶酶体的状态及细胞自噬的变化。利用荧光偶联的细胞膜表面标记GPA的抗体、细胞核染色剂Hoechst 33342和溶酶体标记分子LAMP1抗体进行免疫荧光染色,观察TPP1敲低组和正常组中红系发育终末阶段细胞溶酶体状态的变化,利用流式细胞术、Western Blotting技术定量分析溶酶体的变化。利用荧光偶联的细胞膜表面标记GPA的抗体、细胞核染色剂Hoechst 33342和自噬标志物LC3β抗体进行免疫荧光染色,观察TPP1敲低组和正常组中红系发育终末阶段细胞自噬过程的变化,利用Western Blotting技术定量分析TPP1敲低组和正常组LC3βI向LC3βII的转化,探究自噬过程的变化。5.探究TPP1表达缺失对p53信号通路的影响。根据转录组测序结果和蛋白质组测序结果,结合Western Blotting技术分析部分凋亡相关蛋白的变化,基于p53蛋白表达升高,通过添加p53抑制剂检测对细胞表型的影响,初步探究TPP1敲低后导致细胞凋亡发生的原因。6.探究TPP1表达缺失对胰岛素受体相关通路的影响。结合转录组测序结果和蛋白质组测序结果,并通过q RT-PCR和Western Blotting技术检测胰岛素受体的表达变化,探究TPP1敲低后与胰岛素受体相关通路的关系。结果:1.成功于体外造血干细胞定向红系发育体系中敲低TPP1的表达本实验首先成功构建了sh RNA敲低型载体,并通过慢病毒转染的方式转染脐带血来源的CD34~+造血干细胞和K562细胞系,利用q RT-PCR和Western Blotting技术分别在m RNA水平和蛋白质水平证明TPP1在CD34~+造血干细胞和K562细胞中被有效敲低。2.TPP1敲低后导致细胞增殖抑制、细胞凋亡增加及阻碍晚期细胞的脱核。为了探究TPP1在红系发育过程中的作用,我们在脐带血来源的CD34~+细胞体外诱导向红系分化过程中敲低TPP1的表达,检测红系发育过程中重要的生物学事件。结果显示TPP1敲低后细胞增殖受到抑制,终末分化晚期细胞发生严重的凋亡现象,细胞脱核也受到抑制,而分化与正常组没有显著差异。但是,K562细胞系中敲低TPP1的表达后,细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡均与对照组无显著差异,说明TPP1可能在红系终末分化晚期生物大分子降解,形成成熟红细胞过程中发挥着重要的作用。3.转录组测序和蛋白质组测序结果表明,与正常细胞相比,TPP1表达缺失的细胞在稳态、代谢等方面存在差异。为了探究TPP1敲低后导致的细胞异常的原因,我们分别对TPP1敲低组和正常组进行转录组测序和蛋白质组测序,并利用生物信息学方法分析。GO分析结果显示,与对照组相比,TPP1敲低组在稳态、代谢等方面发生改变,KEGG通路分析发现,自噬、溶酶体、p53信号通路、胰岛素抵抗等信号通路都具有一定差异。4.TPP1敲低后导致溶酶体数量增多,对自噬无显著影响。结合转录组测序结果,为了明确溶酶体水解酶TPP1敲低与溶酶体的关联,我们利用免疫荧光技术检测发现TPP1敲低后溶酶体的形态完整且与对照组无显著差异,利用流式细胞术和Western Blotting技术定量分析溶酶体的变化,结果表明TPP1敲低后溶酶体的数量呈现增加的趋势,这可能说明TPP1敲低后导致溶酶体的部分降解能力下降,导致细胞通过增加溶酶体的数量来弥补降解能力的不足。溶酶体是自噬过程中关键的细胞器,红系发育的晚期阶段自噬也发挥了重要的作用。为了明确TPP1表达缺失对细胞自噬的影响,我们利用免疫荧光技术、流式细胞术和Western Blotting技术检测了细胞自噬过程,发现TPP1敲低后细胞自噬没有发生显著差异,但细胞自噬是一个动态过程,包括自噬小体的形成,自噬体与溶酶体的融合,底物的降解三个过程,在红系发育过程中,需要进一步利用可靠的方法检测细胞自噬的发生过程,从而明确TPP1敲低后导致的细胞异常与细胞自噬之间的联系。5.p53抑制剂不能逆转TPP1敲低导致的细胞增殖受阻和凋亡增加。为了进一步探究TPP1表达缺失导致的细胞功能异常的机制,我们对转录组测序和蛋白质组测序结果进行比对分析,发现p53蛋白的表达上调,并用Western Blotting实验证实了这一结果。为了明确TPP1功能缺失与p53信号通路的关系,我们利用脐带血来源的CD34~+细胞,体外诱导向红系分化过程中敲低TPP1的表达,以p53抑制剂处理后检测相关表型。结果发现,p53抑制剂不能逆转TPP1敲低后导致的细胞增殖受阻、凋亡增加和脱核减少。说明TPP1敲低后导致的细胞凋亡的发生并不依赖于p53信号通路,相关机制还需要进一步的实验研究。6.TPP1敲低后导致胰岛素受体表达明显下降。我们分析转录组测序结果发现,胰岛素相关信号通路发生了改变,同时分析蛋白质测序结果时发现,TPP1敲低后胰岛素受体的表达显著降低,我们也通过q RT-PCR和Western Blotting技术检测发现胰岛素受体在m RNA和蛋白质水平发生显著下降,由于胰岛素受体激活的下游信号通路在红系发育过程中起到极为重要的作用,且其在代谢、细胞生长和分化等方面也具有多方面的功能,我们推测TPP1敲低导致的胰岛素受体表达下降有可能是红系发育终末阶段功能异常的重要机制,但还需进一步的研究验证。结论:综上所述,TPP1在红系终末分化阶段和功能成熟阶段中发挥着重要的调控作用,敲低TPP1会导致细胞增殖受阻、凋亡增加以及脱核率下降等重要细胞功能异常。虽然TPP1敲低引起蛋白p53表达上调,但凋亡增加的发生机制不依赖于p53信号通路异常。TPP1缺失导致溶酶体的数量增加,可能与TPP1缺失降解能力下降有关。TPP1缺失可能导致胰岛素受体相关通路的改变,但具体的机制还需要进一步研究。