猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是目前严重危害养猪业的传染病之一,该病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起。高致病性猪繁殖与呼吸道综合症病毒简HP-PRRSV(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus, HP-PRRSV)以强毒力、高变异性为主要特点,给我国养猪业带来巨大经济损失,使得该病的的防治工作面临严峻挑战。Nsp2是PRRSV中变异最大的基因之一。为研究广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) nsp2基因的变异情况及遗传进化规律,通过RT-PCR方法对近年广西不同地区分离到的34株PRRSV的nsp2部分高变区域并进行了克隆和测序,应用Lasergene、MEGA5.1等生物学软件对序列进行分析。分析结果表明：34株分离毒株nsp2的基因扩增片段大小为1322-1722 bp不等。除了GXYL1403a株外,其余33株PRRSV分离株nsp2基因编码的氨基酸都以不连续的1+29个氨基酸的缺失为主要特点,与JXA1为代表的HP-PRRSV缺失位置相同,但也存在新缺失的情况,相较于VR2332株,GXBS1401a、GXNN1396、GXYL1403e分别缺失31、49和123个氨基酸。GXYL1310、GDHZ1401、GXBH1404株在1+29个氨基酸的缺失的下游还出现120个氨基酸的缺失。此外,GX1407a株在1+29个氨基酸的缺失的下游还出现1个氨基酸的插入。同源性分析表明34株分离株的nsp2基因序列与2006年以来陆续分离的CH-1 a、JXA1、HUN4等毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为77.3%～99.7%和65.9%～99.2%；与VR2332毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别77.4%～99.7%和65.9%～99.2%,其中GXYL1403a株与VR2332株核苷酸和氨基酸同源性分别为99.7%和99.2%,与MLV株核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.7%和99.2%。遗传进化树分析表明,其中33株分离株与其他HP-PRRSV变异株虽然属于同一大分支中但又处于不同的小分支上,表明33株分离株为HP-PRRSV, nsp2基因在PRRSV的流行过程中一直在不断发生着遗传变异,产生新的变异。研究结果揭示了广西地区新近流行PRRSV nsp2基因的变异特征和进化情况,为广西地区PRRS防控工作提供了一定理论依据。为研究nsp2 aa缺失对病毒复制和免疫调控的影响。在HP-PRRSV全长感染性克隆pMJX0612-NM的基础上,通过SOE-PCR方法对nsp2高变区进行人为缺失,构建了数个nsp2部分区域缺失突变的PRRSV全长cDNA克隆(rMJX0612-NM-57/87/264/279/333/432/435)。将突变克隆和亲本质粒转染BHK-21细胞,48小时后,取转染细胞上清感染MARC-145细胞。结果表明,19(87nt)和88(264nt)个氨基酸的缺失并不影响病毒的感染性,其他氨基酸缺失的全长cDNA并不能拯救出病毒,说明这些区域氨基酸缺失对JXM0612毒株来说是致死性的。将拯救出的重组病毒rMJX0612-NM-D87和rJX0612-NM-D264在MARC-145细胞上连续传代,对传代病毒的缺失位点进行测序发现,突变位点稳定存在于传代病毒中。为研究这些氨基酸缺失对病毒复制特性的影响,在MARC-145细胞上分析突变病毒的细胞传代毒(p3)和亲本病毒的生长曲线和空斑形态特征。结果发现突变病毒和亲本病毒有着相似的生长特性。但是与母本病毒相比,在12-48小时,rJX0612-NM-D264病毒滴度更高。空斑实验表明rJX0612-NM-D264空斑形态更大,说明rJX0612-NM-D264的复制能力更强。而rMJX0612-NM-D87的病毒滴度比亲本病毒略低,但空斑形态相似。这些结果说明了nsp2基因中缺失323位至416位氨基酸能够引起病毒在MARC-145细胞中复制增强。我们还进一步分析nsp2 aa缺失对病毒在感染PAM细胞后免疫相关的细胞因子的表达情况的影响。结果表明,缺失病毒和母本病毒感染PAM细胞后,细胞免疫相关的细胞因子的表达出现了不同程度的上调,其中与母本病毒相比,突变病毒导致IL-8、IL-10上调更为明显。在感染后24小时,突变病毒ISG54的表达明显比母本病毒高。实验结果证实了nsp2上不同位置的缺失的确能改变母本病毒所诱导的细胞免疫因子的应答。本课题通过对突变病毒的相关体外研究,了解了nsp2部分区域的缺失对PRRSV复制、细胞噬性以及与免疫相关的细胞因子的表达的影响。研究数据对了解病毒致病机制、毒力变异和研发新型标记疫苗具有重要意义。