番茄灰霉病是一种重要的植物病害,由半知菌亚门灰葡萄孢属(Botrytis cinerea)真菌引起。近年来人们通过大量筛选并加以改良利用抗灰霉病的生防菌,使生物防治技术日益成为控制灰霉病的一条重要而且有效的途径。通过宏基因组技术可以大大提高生防基因的筛选范围,进而对拮抗基因及其蛋白的拮抗机理进行深入研究。本研究在刘舒等人构建的番茄灰霉病病株根际土壤宏基因组文库的基础上,探讨文库中拮抗活性很强的9“克隆子对Botrytis cinerea的拮抗机理。本研究首先对9“克隆子的稳定遗传性进行了检测,经过传代培养10次后,9#克隆子对Botrytis cinerea仍然具有较强的拮抗活性,说明9#克隆子的拮抗性能够稳定遗传。通过提取9#克隆子重组pBluescript II KS+质粒DNA,经PstI和HindⅢ双酶切检测和测序后,证明重组质粒上插入了一段大小2215bp的外源DNA。结合生物信息学工具和软件,对该外源DNA序列进行分析,主要包括DNA序列同源性比对,最大开放阅读框(ORF)的查找,编码蛋白序列的同源性及蛋白的一二三级结构分析。结果表明,该序列在Genebank中进行blastn比对,同源性很低,只有4%,推测可能是新拮抗基因；该序列含有一个612bp的最大ORF,编码一个小分子量疏水性脂溶蛋白,分子量为22.2kDa,与AMP核苷酶序列的同源性较高；模体搜索表明该序列含有5个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和3个N-豆蔻酰化位点,推测该基因可能在拮抗灰葡萄孢菌过程的信号转导中发挥重要作用。为了进一步验证该序列表达产物对Botrytis cinerea的拮抗性,即该序列的最大ORF能否成功表达。以重组pBluescript II KS+质粒DNA为模板,用引物PST-F和HIND-R进行PCR,扩增出外源DNA片段,然后以外源DNA片段为模板,在最大ORF两端设计引物EcoRI-F和SalI-R,经PCR扩增出最大ORF,与pET-32a(+)构建重组表达载体,转化感受态E.coli BL21(DE3)并用IPTG诱导表达,得到相对分子量约为42kDa的融合蛋白,理论推测值与实际表达值相符合。通过对重组菌诱导表达条件的优化,获得了融合蛋白的高效表达条件：在37℃下,50mL LB液体培养基(300mL锥形瓶)中,振荡培养8h获得种子液,种子液按照1：100的比例接种于LB液体培养基(含100μg/mL Amp),37℃下振荡培养3.5h, IPTG诱导4h,获得较高的目的融合蛋白表达量。