基因Ⅶ型新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起了第4次新城疫大流行,传统疫苗（LaSota）免疫的鸡群也会感染,导致免疫鸡群出现非典型新城疫现象,给养禽业造成了严重的经济损失。前期研究结果表明,与早期强毒株相比,基因Ⅶ型NDV在家禽免疫器官中可以进行高效复制,引起免疫器官严重损伤,主要表现为脾脏严重坏死和淋巴细胞耗竭等特征。然而,Ⅶ型NDV造成脾脏严重坏死以及淋巴细胞耗竭的机制尚不明确。虽然已有众多关于基因Ⅶ型NDV引起家禽免疫器官损伤机制的研究,但主要通过传统病理切片等方法,从免疫器官的层面进行研究,而从细胞层面进行的探究鲜有报道。本研究旨在从细胞层面研究基因Ⅶ型NDV诱导鸡脾脏免疫应答与损伤的免疫机制。首先,选择表达绿色荧光蛋白的基因Ⅶ型重组NDV感染鸡,通过多色流式细胞术分析病毒感染引起鸡脾脏免疫细胞的动态变化情况;然后,对脾脏细胞进行转录组学测序分析;最后,利用多色流式细胞术、荧光定量PCR、间接免疫荧光（IFA）等技术鉴定出病毒感染鸡脾脏的主要靶细胞,并且分析了脾脏免疫细胞的凋亡情况和巨噬细胞天然免疫及炎症相关基因的表达水平。1.基因Ⅶ型NDV诱导鸡脾脏免疫应答的特征分析前期研究结果表明,基因Ⅶ型NDV引起鸡脾脏严重损伤,为了分析基因Ⅶ型NDV诱导鸡脾脏的免疫应答特征,我们从先天免疫应答和细胞免疫应答方面进行研究。用表达绿色荧光蛋白的基因Ⅶ型重组NDV感染SPF鸡,并于感染后的2、4、6天采集脾脏并制备单个核细胞悬液,通过流式细胞术分析脾脏巨噬细胞、NK细胞、B细胞以及T细胞亚群的动态变化情况,结果发现,与未感染组相比,感染组鸡脾脏中的天然免疫细胞巨噬细胞数量显著增加,NK细胞数量明显减少,但其占淋巴细胞的比例上升;淋巴细胞的数量显著减少,其中B细胞比例下降,T细胞比例上升,提示病毒感染诱导鸡脾脏细胞Th1偏向的反应。此外,我们选取感染后第2天的脾脏单个核细胞样品进行转录组学测序分析,结果显示,基因Ⅶ型NDV感染鸡脾脏诱导大量的炎性因子,如IFN-γ、IL-6、IL-18等表达上调,并且激活很多天然免疫信号通路,如Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路等相关的基因表达上调（与未感染组相比）。进一步运用荧光定量PCR对差异转录组学数据进行验证,结果显示与转录组测序的结果一致。以上研究结果表明,基因Ⅶ型NDV感染鸡引起脾脏巨噬细胞增多以及淋巴细胞减少,同时诱导强烈的先天性免疫应答及炎症反应,进而对脾脏组织造成严重的损伤。2.基因Ⅶ型NDV感染鸡脾脏的细胞嗜性研究基于上一章节的研究结果发现,基因Ⅶ型NDV感染SPF鸡引起脾脏巨噬细胞显著增多而淋巴细胞显著减少。本章节中,为了探索基因Ⅶ型NDV感染鸡脾脏的主要靶细胞,我们利用表达绿色荧光蛋白的基因Ⅶ型NDV感染SPF鸡,于感染的第2、4、6天采集鸡脾脏并制备单个核细胞悬液。基于制备的脾脏单个核细胞悬液开展以下研究。首先,通过鸡流式抗体KUL01、Bu-1、CD3染色,利用流式细胞仪分选出巨噬细胞、B细胞及T细胞,应用荧光定量PCR检测分选细胞中的病毒拷贝数,结果发现,与其他分选细胞相比,巨噬细胞的相对病毒含量最多;然后,通过多色流式细胞术检测病毒表达的绿色荧光分析各类免疫细胞感染病毒的情况,流式数据显示,与其他细胞相比,巨噬细胞中表达绿色荧光的比例最高;随后,通过免疫荧光技术检测鸡脾脏巨噬细胞感染病毒表达的绿色荧光蛋白,结果发现巨噬细胞显示的红色荧光与病毒的绿色荧光发生明显共定位。此外,我们运用多色流式细胞术检测了不同免疫细胞的凋亡情况,结果显示,与其他免疫细胞相比,巨噬细胞中凋亡细胞比例最高。最后,我们针对巨噬细胞进行了细胞因子的检测,我们发现与未感染组相比,鸡脾脏巨噬细胞中的天然免疫及炎症相关基因显著上调。上述研究结果表明,巨噬细胞是基因Ⅶ型NDV感染鸡脾脏的主要靶细胞,感染病毒后部分巨噬细胞会发生凋亡,而淋巴细胞凋亡不明显,推测淋巴细胞耗竭可能与感染病毒后巨噬细胞发生凋亡或其分泌的细胞因子介导的相关功能有关。总之,本研究从脾脏细胞层面阐明了基因Ⅶ型NDV引起的宿主脾脏免疫应答特征,发现巨噬细胞是病毒感染的主要靶细胞,为基因Ⅶ型NDV引起鸡免疫病理的机制研究提供了新的思路。