[研究背景]缺氧缺血性脑病是指围生期多种因素引起脑供氧、供血减少,导致脑能量代谢及功能障碍,引发多种临床表现如抽搐、昏迷等,严重者引起死亡,经过积极治疗后也多伴有神经系统后遗症,是我国儿童致残重要病因之一。随着国内外围产医学的发展,新生儿窒息尤其是重度窒息的发生率逐年降低,但针对该病的治疗缺乏进展甚微。在国外常规使用亚低温治疗新生儿脑损伤,Meta荟萃分析显示亚低温治疗对新生儿中度脑病作用明显,但对重度脑病的治疗作用一般,但国内该项目开展有限。另外也有研究显示高压氧治疗对于改善缺氧缺血性脑病的治疗意义,研究显示其可以有效改善神经系统症状,降低患儿的病死率和后遗症发生率。但国外相关研究未显示高压氧治疗确证效果。其他的一些治疗包括应用氧自由基抑制剂和清除剂,兴奋性氨基酸拮抗剂、神经保护剂等,多集中在氧化应激通路的干预,目前缺乏新的治疗新生儿缺氧缺血性脑病的靶点。新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)的病因研究显示为脑血流量或供氧减少导致的脑损伤,细胞凋亡在其中发挥重要作用。丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)为介导信号从细胞表面向核内传递的重要通路,参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生理过程,p38 MAPK是MAPKs家族中重要的一员。目前研究显示缺血再灌注损伤时,p38MAPK被磷酸化而活化,引起凋亡相关基因、蛋白的表达。已有使用p38 MAPK抑制剂减轻肾脏、肠缺血再灌注损伤以及大鼠海马区神经元凋亡的报道。课题组前期的研究显示,通过水中充入氮气的方法模拟缺氧环境,可以诱导新生儿斑马鱼脑细胞凋亡,引起凋亡相关蛋白表达异常。[研究目的]基于以上的研究背景,本实验旨在利用斑马鱼模型构建幼鱼缺氧损伤模型,模拟新生儿缺氧缺血性脑损伤的病理生理过程。利用斑马鱼幼鱼行为学观察软件了解p38 MAPK抑制剂对缺氧后复氧的斑马鱼幼鱼自发运动和光刺激反应的影响,从宏观行为学角度探讨抑制剂的干预效果。进一步利用TUNEL方法检测脑细胞凋亡情况的影响,探讨抑制剂干预对脑细胞凋亡的影响。最后利用Westemblot 方法检测脑内的 B 淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific proteases,caspase-3)蛋白的表达情况,rt-qPCR的方法检查相关蛋白的mRNA表达情况,探讨抑制可能发挥作用的分子机制以及最佳的抑制剂干预浓度。[研究方法]1.研究动物由南方医科大学广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选国际合作基地提供野生AB型斑马鱼,下午6点将雌雄斑马鱼按1:1配对,次日8点予光照后自然产卵,受精后2h后于体式显微镜下观察,确定发育阶段并选择正常受精卵置于28℃恒温箱中培养。2.缺氧后复氧模型制备斑马鱼幼鱼缺氧模型制备参考相关文献,通过向水中充入高纯氮气降低水溶氧量的方法模拟缺氧环境,透过密闭水箱的盖孔将幼鱼放入其中,使用溶解氧监测仪监测溶氧浓度至到0.3 mg/L以下模拟缺氧环境。缺氧终点为幼鱼沉于水底、静止不动持续3min,达到终止时间点即迅速取出实验。3.研究分组采用受精后5d的幼鱼作为实验对象,按照随机化原则分为5组,对照组幼鱼正常饲养,模型组和干预组幼鱼制备缺氧模型,造模后模型组幼鱼使用含DMSO(二甲基亚砜)浓度为0.11%的水进行复氧,干预组使用含p38MAPK的特异性抑制剂SB202190的水进行复氧。根据抑制剂浓度干预组分为3个亚组(干预组1/2/3),浓度分别为5、10和20 μmol/L,复氧后3h作为观察终点。4.观察指标及实验方法4.1运动行为观察采用ZebraLab幼鱼运动行为记录系统进行行为学观察,幼鱼进入记录仪中适应5分钟后,采集自发运动视频。之后开启底灯强光照射1分钟后迅速关闭,观察幼鱼行为轨迹变化情况,完成光刺激反应实验。应用系统软件将运动轨迹可视化,计算得到幼鱼移动距离、运动速度等运动参数。4.2细胞凋亡检测各组取8条幼鱼用多聚甲醛固定,4℃保存用于切片。全鱼标本经脱水石蜡包埋后经双眼平面经额面连续切片取全脑,利用瑞士 Roche公司荧光TUNEL试剂盒进行染色。利用倒置荧光显微镜下观察凋亡细胞以及Image-Pro Plus 6.0软件计算神经细胞凋亡指数(AI),AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%。4.3蛋白检测Western blot 法检测磷酸化 p38 MAPK、p38 MAPK、Bcl-2、Bax 及活化的caspase-3蛋白表达量。提取全脑组织总蛋白,BCA法测蛋白浓度。制胶后上样,SDS-PAGE凝胶电泳,将PVDF膜分别在兔抗β-actin(1:1000)、兔抗以上蛋白抗体中4℃孵育过夜。使用Alpha Innotech分析条带灰度值,以β-actin为内参计算目的蛋白相对表达量。4.4基因检测取全脑组织用RNAisoPlus试剂(日本Takara)抽提脑组织总RNA,依照Prime Script(?)RT reagent Kit逆转录试剂盒(日本Takara)操作步骤逆转录合成cDNA。以β-actin为内参,引物由上海捷瑞生物科技公司合成。根据SYBR(?)Premix Ex TaqTM Ⅱ 说明书(日本 TaKaRa 公司)加样,在 Roche Light Cycler(?)Nano仪器上进行qPCR反应,每组设3个复孔。通过软件计算2-△△t值,以2-△△Ct值表示基因mRNA的相对表达量。4.5统计分析采用SAS9.2软件进行数据统计分析。计量资料均以Mean± sd,计数资料以N(%)进行统计描述,计量资料比较采用t检验或方差分析,计数资料比较采用卡方检验,组间两两比较采用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1.自发运动情况模型组及干预组移动距离和运动速度低于对照组(P＜0.01),提示缺氧/复氧损伤幼鱼运动行为。干预组2的高速/低速运动持续时间及距离均高于模型组和干预组1(P<0.05),与干预组3比较差异无统计学意义(P>0.05),提示10和20 μ mol/L浓度的抑制剂对缺氧后复氧引起的行为学损伤均有保护作用。2.光刺激反应光刺激后幼鱼均表现为移动速度加剧,撤除强光后移动速度逐渐减慢。撤除强光后6min,模型组和干预组1仍较活跃,移动速度高于其他组(P<0.01),提示缺氧/复氧损伤后幼鱼光敏感性增强。对照组、干预组2和干预组3幼鱼活动恢复光照前水平,组间比较差异无统计学意义(P>0.05),提示10和20 μmol/L浓度的抑制剂对光刺激反应均有保护作用。3.脑细胞凋亡检测荧光TUNEL染色结果显示,模型组AI指数(%)高于对照组(P<0.01),提示缺氧/复氧损伤引起脑细胞凋亡,而干预组AI均小于模型组(P<0.01),其中干预组2最低,干预组3次之,干预组1最高(P<0.01),提示抑制剂降低缺氧/复氧损伤后脑细胞凋亡。4.脑组织凋亡相关蛋白表达Western blot结果显示,模型组及干预组幼鱼脑部磷酸化p38/p38蛋白比例高于对照组(P<0.01),而干预组磷酸化p38/p38蛋白比例均低于模型组(P<0.01),提示SB202190抑制缺氧诱导的p38蛋白磷酸化。干预组2和干预组3的Bcl-2蛋白表达量均高于模型组(P＜P0.01),提示抑制剂增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。干预组2和3的Bax蛋白表达均低于模型组和干预组1(P<0.05),干预组1和2的caspase-3蛋白表达均低于模型组(P<0.05),提示抑制剂降低凋亡诱导蛋白的表达。5.脑组织凋亡相关蛋白mRNA表达模型组及干预组Bcl-2、Bax及caspase-3的mRNA表达较对照组升高(P<0.01),提示缺氧可以引起凋亡相关蛋白mRNA的表达升高。干预组2的Bcl-2表达高于模型组和干预组3(P<0.01),干预组2和3的Bax表达低于模型组和干预组1(P<0.01),干预组2的caspase-3表达水平低于模型组和干预组1(P<0.01),提示抑制剂可以增加抗凋亡蛋白(Bcl-2)以及降低诱导凋亡蛋白(Bax/caspase-3)mRNA 的表达。[结论]1.p38 MAPK通路在缺氧后复氧损伤中发挥重要作用,可能通过调控凋亡相关蛋白表达发挥功能。2.p38MAPK抑制剂可以降低缺氧后脑细胞凋亡以及凋亡诱导蛋白、mRNA的表达,表观上显现为幼鱼运动行为能力的提高。3.从幼鱼运动行为的观察以及蛋白、基因表达上的分析,10μmol/L的抑制剂浓度发挥保护作用的效果最佳。