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玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63是一株从马铃薯疮痂病自然衰退土壤中分离的生防菌,能够产生多种脂溶性抗生素,对多种植物病原真菌有抑制作用。 A-因子及其类似物作为一种微生物激素广泛存在于多种链霉菌中,其上均含有一个γ-丁酸酯环结构。A-因子及其类似物对链霉菌的代谢和菌体形态分化具有重大调控作用,可调控链霉菌的气生菌丝生长、孢子形成以及次级代谢产物的形成。研究发现afsA基因家族能够编码链霉菌A-因子及其类似物合成过程中的一种关键酶。本实验室前期工作中将玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素合成基因簇定位于其线性质粒pSR47上,生物信息学分析发现pSR47含有afsA家族基因srpA。 本研究通过基因敲除技术进行srpA基因的功能分析。主要研究结果如下: 1)构建srpA基因敲除载体pKC1139-srpAF-tsr-srpAR,应用接合转移技术将pKC1139-srpAF-tsr-srpAR转入玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63,初筛获得硫链丝菌素抗性突变株。 2)分别提取野生株和srpA突变株48h、60h、72h、84h菌丝体总RNA,进行逆转录PCR检测。发现不同时间段内野生株均有srpA的转录物存在,srpA缺失突变株则无srpA,这在转录水平上证明突变株srpA敲除成功。 3)生长曲线测定表明:与野生株相比,srpA缺失突变株在液体培养过程中生长率以及生物量均较低。 4)菌落形态表型观察表明:与野生株相比,srpA缺失突变株其基内菌丝、气生菌丝与孢子链的形成在时间上被推迟;野生株会产生大量的气生菌丝与浅粉色的孢子,而srpA缺失突变株只能产生少量的气生菌丝与少量无色的孢子;野生株的基内菌丝会产生柠檬黄色素,而srpA缺失突变株则没有柠檬黄色素产生。 5)抑菌实验结果显示野生型玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63对棉花黄萎病有拮抗作用,可以产生明显的抑菌圈,而srpA缺失突变株失去对棉花黄萎病的拮抗作用。