【摘 要】
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乳腺生物反应器是当前国内外研究的热点课题，从理论上讲，乳腺上皮细胞转染乳腺特异性表达融合基因，再进行核移植是可行的，但国内外成功的报道极少。在体细胞核移植和乳腺生物反应器制作成功报道的基础之上，本课题将乳腺特异性表达载体的构建、奶山羊乳腺上皮细胞（GMFC）系的建立、外源基因转染奶山羊乳腺上皮细胞及转染细胞株的建立等几个方面结合起来，进行转基因体细胞核移植的相关研究，通过前期细胞水平的整合和表达检
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乳腺生物反应器是当前国内外研究的热点课题，从理论上讲，乳腺上皮细胞转染乳腺特异性表达融合基因，再进行核移植是可行的，但国内外成功的报道极少。在体细胞核移植和乳腺生物反应器制作成功报道的基础之上，本课题将乳腺特异性表达载体的构建、奶山羊乳腺上皮细胞（GMFC）系的建立、外源基因转染奶山羊乳腺上皮细胞及转染细胞株的建立等几个方面结合起来，进行转基因体细胞核移植的相关研究，通过前期细胞水平的整合和表达检测，挑选阳性细胞株进行克隆羊的制作，旨在降低乳腺生物反应器的制作成本，从而搭建一个可行的制作转基因动物的平台，利于进一步的科学研究和实际应用。 1 乳腺特异性表达载体的构建 本实验利用实验室已有的人乳铁蛋白cDNA、奶山羊β-乳球蛋白（β-BLG）5｀端（4.2Kb）、3｀端（1.8Kb）表达调控序列、Neor、增强子序列构建出乳腺特异性表达载体BLC-14。 2 奶山羊乳腺上皮细胞系的建立 本实验用胰蛋白酶组织消化液乳导管注射消化、细胞收集法和乳腺组织块胶原酶消化两种方法从泌乳奶山羊的乳腺实质组织中分离得到原代乳腺上皮细胞，DMEM/F12培养液传代培养。对两种方法取的细胞的生长状况进行比较，结果显示胰蛋白酶直接消化法获得的细胞在体外培养至10代左右，细胞开始衰老；胶原酶消化法获得的细胞在体外培养25代以上仍能保持旺盛的生命力，但上皮细胞中含成纤维样细胞混合生长，传代时采用分步胰酶消化反复贴壁法，经2～3次的选择传代可获得比较纯的乳腺上皮细胞系。 3 人乳铁蛋白基因转染奶山羊乳腺上皮细胞及细胞株的建立 通过电转染法将含有Neor标记基因的BLC-14载体基因片段导入奶山羊乳腺上皮细胞，经G418（400μg/ml）筛选培养三周后，得到有抗性的细胞株，挑取单克
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