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柑橘溃疡病是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)引起的一种细菌性病害,它往往给柑橘产业造成非常严重的经济损失。柑橘产业中大部分栽培品种属于溃疡病易感品种。因此,大力开展柑橘溃疡病抗、感机理和重要基因资源挖掘的研究,对柑橘优良抗性新品种的选育和柑橘产业的健康稳定发展具有重要意义,也将进一步深化我们对病原菌致病机理、植物与病原互作机制的理解。研究表明,在溃疡病病原菌侵染柑橘时,可诱导柑橘感病基因表达,致使柑橘发病,感病基因在整个过程中发挥了重要的调控作用。通过突变或沉默感病基因,柑橘可能会获得广谱抗病性,感病基因也可能会转变成为广谱抗病基因,这也为柑橘抗病育种改良提供了一个新思路。 CsLOB1基因为LBD转录因子基因家族中的一员,属感病基因,它受溃疡病菌诱导表达,但其参与柑橘寄主感病的机制尚未清楚。本实验前期工作构建了CsLOB1基因的RNAi表达载体和超量表达载体,利用农杆菌介导将其导入锦橙,获得转基因锦橙。本研究主要从野生型不同抗性品种CsLOB1基因表达特征、转基因锦橙的抗病性、CsLOB1基因的异位表达对相关基因的影响等方面初步探讨CsLOB1感病基因在柑橘溃疡病抗性中的功能。主要研究结果如下: 1.不同抗性品种CsLOB1基因的表达谱 无论锦橙还是金柑,均是刚展开幼叶中CsLOB1基因的表达水平高于嫩叶和老叶。 分别对野生型锦橙(易感)和野生型金柑(抗病)进行溃疡病离体接菌,1d、3d、5d、7d、9d后进行CsLOB1基因的实时定量PCR分析,结果显示,随接菌时间的延长该基因的表达水平呈上升趋势,且各时期该基因的在锦橙中的表达水平均显著高于金柑。显示CsLOB1基因的表达与柑橘溃疡病抗性紧密相关。 2.异位表达CsLOB1基因对柑橘溃疡病抗性的影响 对转基因锦橙离体抗性评价表明,超量表达CsLOB1基因能显著增强转基因植株的感病性,而RNAi抑制CsLOB1基因的表达能显著增强转基因植株的抗病性。 3.异位表达CsLOB1基因对转基因植株表型的影响 观察发现超量表达CsLOB1基因的锦橙与同代野生型锦橙有明显的表型差异,出现植株矮小,叶片皱褶成簇且较小,分支严重等情况;嫁接后代成活率很低,尤其表型特异植株后代基本均未成活。而抑制CsLOB1基因的表达对转基因植株无明显的表型影响。 4.CsLOB1基因的亚细胞定位 构建融合基因表达载体PLGN-35s-CsLOB1:mGFP,利用农杆菌介导转化洋葱表皮细胞,荧光显微镜观察结果显示,CsLOB1:mGFP蛋白在细胞核优势富集,表明CsLOB1基因定位于细胞核。 5.异位表达CsLOB1基因对细胞壁重构相关基因的影响 对转基因锦橙中的扩张蛋白基因、果胶裂解酶基因和酸性纤维素酶基因的表达进行定量PCR分析,结果显示,超量表达CsLOB1基因的转基因锦橙中三个基因的表达水平显著上调,而RNAi抑制CsLOB1基因的转基因锦橙中,三个基因的表达水平下调,但下调并不显著。表明CsLOB1基因可能通过调控细胞壁重构相关基因来响应柑橘溃疡病的侵染。