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蛋白质做为重要的生物大分子,是由氨基酸分子形成的长链,是生命活动的主要承担者。研究蛋白质的功能需要深入了解它们的结构,特别是三维空间结构,因为结构决定了功能。根据分子生物学中心法则,遗传信息是由DNA到RNA再到蛋白质的。经过多年的研究,人们对由DNA到RNA再到多肽链的过程已基本清楚,但是怎样由一定的氨基酸排列的多肽链生成具有特定的空间结构的蛋白质的问题仍未解决。因而揭示蛋白质分子在不同的环境中如何折叠成特定的功能结构,是分子生物学研究中的核心问题之一。我们的工作就是根据蛋白质的体外变性复性实验,采用血清蛋白和溶菌酶来研究蛋白质折叠过程中路径的变化,中间态的出现,不同相互作用力的竞争,以及蛋白质自身构象的改变。同时蛋白质的正确折叠和错误折叠相互竞争。在一定的条件下,蛋白质会发生错误折叠,最终形成淀粉样纤维结构。这种病理性的聚集一旦形成,就不可逆转,具有细胞毒性,引起疾病,如疯牛病、帕金森症等。因此,蛋白质折叠的研究不仅在理论上有重要的意义,而且在预防和治疗相关疾病方面有重大的应用前景。 本论文主要对牛血清蛋白和鸡蛋白溶菌酶等折叠的热力学和动力学特性以及其错误折叠引起的聚集情况进行了系统的研究,另外对酶和底物的结合特性也有部分涉及。本论文主要分为六部分,论文主要内容如下: 研究一:血清白蛋白是血液中重要的输运蛋白,可以与脂肪酸、金属离子等小分子结合。在中性条件下,Tayyab认为由于阴离子的稳定作用血清蛋白折叠的协作性提高,表现为两态折叠,即天然态到变性态。但是这一变化只是根据蛋白质的三级变化,具有一定的局限性。我们根据荧光和圆二色等手段表征蛋白质变性过程中二级和三级结构变化,发现二级结构和三级结构解折叠不同步,有部分变性的中间态存在,因此我们提出了血清蛋白的折叠是三态过程,即天然态,中间态和变性态,并且分析了三态的构象变化。同时我们加入钙锌镉钴等不同金属离子来分析血清蛋白和金属离子配体之间的相互作用,以及对折叠路径的变化。十分有趣的是,钙隔的出现使血清蛋白折叠路径由三态变回两态,而锌钴更加破坏了了二级结构和三级结构解折叠的协作性。 研究二:溶菌酶是是一种糖苷水解酶,也是研究蛋白质折叠的重要模型蛋白之一。鸡蛋白溶菌酶和人溶菌酶同源,有129个氨基酸组成两个结构域(29%的α螺旋和42%的β片)。溶菌酶的折叠具有2条路经,少量分子快速塌缩形成2个结构域(α和β域),然后形成三级结构;大部分分子首先形成螺旋结构域,然后形成β片结构域,最后两域构成三级结构。由于蛋白质折叠速度快,很多微观现象难以捕捉,因此我们采用国际先进的快速停止流仪器并且加入甘油提高溶液的粘性,来观测溶菌酶秒级的折叠动力学过程。通过平衡观测,我们发现甘油的加入提高了溶菌酶的稳定性,构象更加紧凑。在动力学过程中,我们发现溶菌酶在早期的折叠过程中,螺旋结构过量,需要先解折叠到天然态,然后继续折叠。当甘油加入,疏水作用和氢键相互竞争,导致过量的螺旋结构消失,但是由于大量的疏水核的形成,整个蛋白的折叠被减慢。同时我们研究了辐射对蛋白质结构的危害。通过蛋白质结构比对,我们发现溶菌酶、乳白蛋白以及免疫球蛋白等虽然序列相似性很低,但结构上都具有芳香氨基酸和二硫键空间临近的构象。芳香氨基酸是蛋白质重要的吸光氨基酸,这一结构对蛋白质抗紫外辐射有重要的意义。通过巯基定量和蛋白质结构监测,我们发现二硫键和芳香氨基酸之间存在能量转移,有效的减缓了辐射对蛋白质的破坏。但是过度的辐射会导致二硫键的断裂,对蛋白质造成伤害。 研究三:蛋白质从核糖体释放的那一刻起,多肽链的正确折叠和错误折叠就相互竞争。一旦错误折叠,就会导致细胞功能的丧失,引起疾病。蛋白质自组装聚集形成淀粉样沉淀的原因是多方面的。肽链本身的氨基酸序列,温度,变性剂和外界的压力等都可以导致蛋白质构象变化,形成纤维状沉淀。淀粉样纤维主要由交叉的β折叠片组成,对于正常的蛋白质都具有丰富的螺旋结构,蛋白质如何从螺旋变成β折叠片是理解蛋白质聚集机制的关键。首先我们发现血清蛋白在尿素变性条件下形成聚集,超声可以诱导溶菌酶形成淀粉样聚集。接着根据溶菌酶在部分变性条件下能够形成淀粉样聚集,以及三氟乙酸等有机溶剂能够诱导蛋白质形成螺旋结构,我们研究了溶菌酶在不同的溶剂环境下从螺旋到β折叠片的转变。通过比较我们发现溶菌酶在乙醇和三氟乙酸溶剂中能够形成淀粉样聚集,但是聚集速度减慢,并且聚集的速度和形貌和溶剂环境有关。 研究四:随着抗生素广泛而大量的应用,细菌对抗生素逐渐产生了抗药性,大大地限制了抗生素的应用。其中,最主要的原因还是细菌产生出一系列修饰酶,共价修饰抗生素的某些特定的氨基或者羟基基团,干扰抗生素和核糖体的结合,从而使抗生素失去药性。氨基糖苷类磷酸修饰酶APH(3)-Ⅲ是最常见的修饰酶之一,能够修饰卡那霉素和新霉素类等多种抗生素。在体内,磷酸修饰酶以ATP和镁离子为底物,将ATP的γ磷酸转移到修饰抗生素的3或者5羟基。这一催化过程遵循Theorell-Chance机制,首先是金属离子-ATP结合到酶上,然后再捕获抗生素,催化完成后,ATP变成ADP,磷酸化的抗生素先释放,再释放ADP。随着APH以及APH和底物的晶体结构的获得,我们发现磷酸修饰酶和丝氨酸/苏氨酸以及酪氨酸激酶等Kinase家族的蛋白质在结构和功能上很相似。通过大量实验,我们主要研究了酶和抗生素底物相互作用的热力学和动力学性质。通过热量测试,我们发现在酶和底物的相互作用过程中,焓的贡献抵消了熵的减少,从而使复合物得到最低的自由能。通过顺磁离子-锰对磷酸酶和ATP,金属离子以及不同抗生素的结合常数和化学计量浓度的比较,我们发现ATP的出现大大提高了抗生素和金属离子的结合系数,同时不同的金属离子也改变了磷酸修饰酶的底物特异性。这些类似的性质在基糖苷腺苷转移酶等反应中也有发现。这些共同的作用机制的揭示将有助于设计抑制剂来同时失活这些修饰酶。