论文部分内容阅读
前言细胞色素P450 2D6(cytochromesP450 2D6,CYP2D6)是肝脏中重要的Ⅰ相代谢酶,烟草中特异性前致癌物在体内经CYP2D6代谢活化成为终致癌物,形成DNA加合物,造成细胞损伤,可能涉及吸烟引起的肺癌变过程。CYP2D6表型和基因型有显著的种族差异。亚洲人常见的单核苷酸多态之一是外显子9 G4268→C颠换,造成了Ser(丝氨酸)486→Thr(苏氨酸)氨基酸取代,导致表达的酶活性降低,另一个亚洲人常见的单核苷酸多态之一是CYP2D6外显子1 C188→T转换,造成Pro(脯氨酸)34→Ser氨基酸取代,导致编码的酶不稳定,降低CYP2D6的活性,减少对前致癌物的代谢,可能影响个体肺癌易感性。核苷酸切除修复系(nucleotide excision repair, NER)包括很多修复基因,其中ERCC1 (excision repair cross-complementing 1, ERCC1)定位于人类染色体19q13.2-19q13.3,大小为33kb,包含有17个外显纯化的ERCC1蛋白,由633个氨基酸残基组成,是NER活性的标志性基因,也是细胞存活必须的DNA修复基因,其编码产物是297个氨基酸,其多态性位点与肺癌易感性关系的研究并不是太多,所以这也是一个值得研究的方向。本研究采用病例-对照方法,探讨辽宁地区CYP2D6基因G4268C、C188T和ERCC1基因C8092A位点的单核苷酸多态性对肺癌发生的影响。材料和方法一、实验材料(一)研究对象本研究采用病例-对照研究方法,肺癌患者和对照者各200例。标本取自中国医科大学附属第一医院2009年5月至2009年12月间经病理学证实的原发性肺癌患者和体检的正常个体,均为辽宁地区的汉族人。(二)实验仪器及试剂PCR仪,电泳仪；KI,氯仿,异戊醇,异丙醇,乙醇,TAKARA公司的PCR试剂盒,限制性核酸内切酶BstEII(PROMEGA), Hph(NEB), MboII(TAKARA)。二、实验方法(一)KI法快速抽提人外周血基因组DNA(二)PCR反应设计引物序列,配制体系,进行PCR扩增反应(三) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism,限制性内切酶片段长度多态性)酶切反应取上述PCR产物加入限制性核酸内切酶,37℃水浴。取酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳,染色后分析。(四)统计学分析用SPSS11.5软件,对数据进行Hardy-Weinberg平衡检验,x2检验分析CYP2D6和ERCC1基因多态性与肺癌的关系,以比值比(OR)及其95%可信限(CI)表示关系的相对强度,检验水准α=0.05。实验结果一、研究对象基本资料本研究共有肺癌患者男132人,女68人,平均年龄54(24-82)岁,对照组男135人,女65人,平均年龄55岁(27-80)岁。两组人群性别构成和平均年龄无统计学差异(P>0.05)。按WHO(1984年)关于吸烟调查方法的标准,每天吸烟量超过一支持续半年以上定义为吸烟者,累计吸烟量(支·年)=每天吸烟支数×吸烟年数。吸烟轻重度分界以对照组吸烟人群累计吸烟量中位数400支·年为标准,累计吸烟量≥400支·年为重度吸烟,累计吸烟量<400支·年为轻中度吸烟。肺癌组吸烟人数比例及重度吸烟人数比例均高于对照组(P<0.05)。吸烟者与不吸烟者比较,患肺癌的危险性增高[OR=3.16(95%CI=1.97-5.06)]。二、G4268C基因型与肺癌发病风险(一)对照组等位基因频率处于Hardy-Weinberg平衡状态(x2=2.52,P>0.60),该人群具有代表性。G4268／G、G4268／C和C4268／C这3种基因型在病例和对照组的分布频率分别为1.50%、58.00%、40.50%和2.50%、44.00%、53.50%;两组人群4268C等位基因频率分别为69.50%和76.50%,差别无统计学意义。非C4268／C基因型的个体发生肺癌的风险是C4268／C基因型个体的1.73倍(95%CI=1.02-2.95),尤其在腺癌中OR=2.75(95%CI=1.27-5.94)。(二)以携带C4268／C基因型而又不吸烟者为参照,C4268／C基因型吸烟者OR=2.61(95%CI=1.02-4.84),非C4268／C基因型不吸烟者OR=2.59(95%CI=1.24-4.69),非C4268／C基因型与吸烟的联合作用OR=5.29(95%CI=2.31-8.57),高于二者的单独作用程度。(三)在轻中度吸烟人群中C4268／C基因型OR值为0.29(95%CI=0.03-1.92),非C4268／C的OR值为3.41(95%CI=1.24-9.93),与肺癌具有强关联；重度吸烟者均与肺癌发生有强关联,重度吸烟人群中携带C4268／C基因型者肺癌危险度的OR值为6.36(95%CI=2.48-19.51),携带非C4268／C基因型者OR值为3.26(1.48-7.87),未发现C4268／C基因型的保护作用。三、C188T基因型与肺癌发病风险(一)对照组等位基因频率处于Hardy-Weinberg平衡状态(x2=3.75,P>0.05),可认为该人群具有代表性。C188／C、C188／T和T188／T这3种基因型在病例组和对照组的分布频率分别为21.00%、49.50%、29.50%和18.50%、39.00%、42.50%；188T等位基因频率分别为54.25%和62.00%,两组人群等位基因频率差别无统计学意义。非T188／T基因型的个体发生肺癌的风险是T188／T基因型个体的1.78倍(95%CI=1.10-3.04),尤其在鳞癌中OR=2.57(95%CI=1.13-5.46)。(二)以携带T188／T基因型而又不吸烟者为参照,T188／T基因型吸烟者OR=3.21(95%CI=1.23-7.48),非T188／T基因型不吸烟者OR=2.19(95%CI=1.05-4.37),非T188／T基因型与吸烟的联合作用OR=3.84(95%CI=1.69-8.72),高于二者的单独作用程度。(三)在轻中度吸烟人群中T188／T基因型OR值为0.39(95%CI=0.06-1.92),非T188／T基因型OR值为3.41(95%CI=1.24-9.93),与肺癌具有强关联；重度吸烟者均与肺癌发生有强关联。四、C8092A基因型与肺癌发病风险对照组等位基因频率处于Hardy-Weinberg平衡状态(x2=3.75,P>0.05),该人群具有代表性。C8092／C、C8092／A和A8092／A这3种基因型在病例组和对照组的分布频率分别为18.50%、38.00%、43.50%和19.00%、39.50%、41.50%；8092A等位基因频率分别为62.50%和61.25%,两组人群等位基因频率差别无统计学意义。非A8092／A基因型的个体发生肺癌的风险是A8092／A基因型个体的0.98(95%CI=0.59-2.04)。讨论CYP2D6多态性与肺癌易感性关系的研究结果常常相互矛盾。有研究显示CYP2D6多态性与肺癌危险性相关,随着CYP2D6活性增加,烟草对肺癌危险度的作用也增加,而且这种作用随烟草消耗的增加而增加,从而证实了CYP2D6活性可修饰烟草对肺癌危险度的作用,但也有研究否认这种相关性的存在。本研究结果提示,CYP2D6非C4268／C和T188／T基因型与肺癌具有中等程度的关联,非C4268／C基因型使腺癌风险升高。肺癌是由环境暴露和个体遗传因素相互作用所导致的多因素多阶段的慢性疾病,在肺癌发生过程中,吸烟这一暴露因子作为肺癌的高危因素所产生的主效应有可能掩盖个体G4268C和C188T多态基因对肺癌易感性产生的影响。非C4268／C和非T188／T基因型与吸烟的联合作用高于两者单独作用程度,但在肺癌的发生过程中两者不具有协同性,吸烟与非变异体之间的具体联合作用模式及机制需要进一步深入研究。虽然ERCC1C8092A与铂类药物化疗敏感性的关系已经开始被研究出来,但本研究并未发现其多态性与肺癌易感性有关联。