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目的: 日常生活中,常会发生烫伤等意外,对于烫伤创面的处理、治疗以及如何缩短愈合时间和提高愈合质量成为临床与基础研究的主要挑战。bFGF对于创面愈合有着卓越的疗效,但其存在半衰期短、生物活性低,以及易滞留于创面表面,难以深达创面内部,而造成创面愈合不完全的缺陷。同时,烫伤创面表面会伴有渗出液,渗出液中所含的MMPs会降解bFGF,造成bFGF的损失。本课题通过脂质体的包封来延缓bFGF的半衰期,并且携载bFGF穿过皮肤表皮到达真皮层发挥修复治疗作用,同时防止其被 MMPs 降解,同时脂质体能为创面提供湿润环境,促进修复。而在脂质体的制备过程中,bFGF易被损耗,因此,加入具有无毒、高吸附性、生物相容性以及低免疫原性的丝素蛋白凝胶,来吸附、稳定 bFGF,避免 bFGF 在制备过程中的损失。此外制备所得的丝素纳米凝胶核与脂质体能共同发挥缓释bFGF的作用,达到一种双重缓释的效果。因此,使用脂质体包裹 bFGF丝素蛋白凝胶核治疗小鼠皮肤烫伤是一种理想的治疗策略。此外,本课题还对bFGF治疗小鼠皮肤烫伤的修复机制以及抑制创面瘢痕做了初步的探究。 方法: 通过逆向蒸发法制备包载bFGF丝素蛋白凝胶核脂质体,通过动态光散射检测器检测SF-bFGF-LIP的粒径分布;通过Elisa试剂盒检测脂质体的包封率及稳定性;通过透射电镜观察丝素蛋白凝胶核形态以及傅里叶变换红外光谱学检测凝胶二级结构;通过Elisa检测SF-bFGF-LIP在渗出液中的稳定性;通过FITC标记bFGF,对SF-bFGF-LIP的穿透能力进行检测。在细胞实验上,通过CCK-8以及细胞划痕实验检测 SF-bFGF-LIP 在渗出液中处理后对于小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH 3T3)的促增殖和促迁移活性。 建立 C57BL/6 小鼠烫伤模型。4%水合氯醛(0.1ml/10g)腹腔注射麻醉,剃去老鼠背部毛发,用脱毛膏去除干净后,生理盐水擦拭干净,放回鼠笼。第二天,将小鼠麻醉后,酒精擦拭背部皮肤,使用6-0尼龙缝合线将环形胶圈固定 (内径8 mm,外径16 mm,厚度0.5 mm)在皮肤表面,防止皮肤皱缩,后将在沸水中煮沸的直径为5 mm的圆柱型铁砣放于圆形胶圈中紧贴小鼠皮肤持续10 s,造成小鼠皮肤深二度烫伤模型。 动物随机分为五组,分别是生理盐水组、bFGF 组、SF-LIP 组、bFGF-LIP组和SF-bFGF-LIP,单剂量(600 ngbFGF/创面)给药,每3天一次。分别在第2、5、8、11、14天测量创面面积。通过统计创面愈合率(创面愈合率(%)=(造模第一天创面面积—取材日创面面积)/造模第一天创面面积×100%),于药物干预第14天后,处理动物,取下全层皮肤组织,进行石蜡包埋,HE染色观察创面肉芽组织的形成,Masson 染色观察创面胶原的沉积,细胞角蛋白的免疫组化染色观察创面再上皮化程度,CD31/α-SMA荧光双染观察创面血管生成,激光多普勒血流评估仪以及血管造影评估创面血流量,collagen I和collagen III的免疫组化染色观察 SF-bFGF-LIP 对创面瘢痕的抑制效果,天狼星红染色观察胶原方向的排布以及Fibronectin 和Laminin染色现象分析SF-bFGF-LIP对创面瘢痕抑制的机制。 结果: 逆向蒸发法制备的 SF-bFGF-LIP 的粒径约为 91 nm;SF-bFGF(60μg/ml)能完全包封于脂质体;SF-bFGF-LIP放置7天时的漏药率为40.9%,展现了脂质体的高稳定性;而 SF-bFGF-LIP 在创面渗出液中孵育后,在第 7 天时SF-bFGF-LIP中的bFGF有29.8%的残留,高于bFGF-LIP组几乎两倍的残留量,可知丝素蛋白凝胶核能有效稳定bFGF。细胞实验结果得出,在渗出液中孵育过后的SF-bFGF-LIP给药组的细胞的活性以及迁移速率都高于其他组。FITC标记bFGF之后,在荧光显微镜下能观察SF-bFGF-LIP穿透到皮肤真皮深处,证明了脂质体的穿透能力。从动物实验中得出,SF-bFGF-LIP能有效促进创面肉芽组织的形成、胶原的沉积、血管的生成以及再上皮化,同时有效降低的瘢痕的生成率,提高了创面修复质量。 结论: 在脂质体的制备过程中,丝素凝胶核能吸附bFGF,防止其制备过程中的损耗以及治疗过程中的降解,SF-bFGF-LIP能高效地携载bFGF达到皮肤真皮层,起到修复治疗作用,加快创面愈合。本课题的结果表明 bFGF 通过上调VEGF的表达来促进血管修复,也通过促进角质细胞、成纤维细胞的增殖和迁移,促进肉芽组织形成和血管生成,从而促进伤口愈合,同时通过调节胶原的分布方向以及Fibronectin 和Laminin的表达来抑制瘢痕生成,提高创面修复质量。