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在自然界中,根据光合作用类型的不同,可以将高等植物分为三类:C3,C4,景天酸代谢(crassulacean acid metabolism,CAM)植物。在C4植物中,光合作用最重要的限速酶是丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate,orthophosphate dikinase,PPDK),它能催化丙酮酸生成磷酸烯醇式丙酮酸的可逆磷酸化反应。作为C02的最初受体,磷酸烯醇式丙酮酸在光合作用中起着重要作用。在玉米中,PPDK蛋白的活性通过其527位苏氨酸残基(T527)的可逆磷酸化而受到光照严格调控,这一过程由一个单一的双功能酶,丙酮酸磷酸双激酶调节蛋白(pyruvate,orthophosphate dikinase regulatory protein,PDRP)催化完成。在黑暗条件下,PDRP能够依赖ADP作为磷酸基团供体,磷酸化PPDK苏氨酸残基从而导致PPDK失活;在光照条件下,PDRP依赖磷酸根离子对PPDK进行去磷酸化从而激活PPDK。但是,PDRP如何行使其双功能酶活的分子机制并不清楚,并且PDRP作为一类特殊的依赖于ADP和磷酸根离子的激酶和焦磷酸酶,其结构基础也尚不明晰。为了解决上述问题,本论文通过结构生物学结合生物化学与分子生物学技术对此进行了深入研究。本论文通过大量筛选玉米PDRP不同截短蛋白片段,获得PDRP42-426蛋白晶体,最终使用单波长异常散射法解析了 PDRP42-426·AMP复合物结构。结果显示,PDRP形成致密的二聚体结构,除了氢键和盐键网络外,PDRP二聚体的形成还依赖于四对二硫键。PDRP单体结构由两个单独的 N 端结构域(N-terminaldomain,NTD)和 C 端结构域(C-terminaldomain,CTD)以及连接它们的loop构成。有意思的是,NTD和CTD有着相似的蛋白折叠类型,均由三到四个α螺旋和四条平行的β折叠片层堆积形成“三明治”结构,其中CTD包含保守的结合核苷酸小分子的P-loop结构。NTD的Dali比对结果绝大部分是蛋白质受体,表明NTD的主要功能可能是作为体内PDRP酶活的变构调节因子,或者提供与PPDK蛋白相互作用的位点。CTD的Dali比对结果与全长PDRP一致,都类似于一类核苷酸激酶结构,通过将CTD与核苷酸激酶的典型结构进行比对后发现,PDRP主要利用P-loop和lid-like domain结合ADP和镁离子。体外的激酶和焦磷酸酶活力实验表明单独的CTD就具有与全长PDRP类似的酶活,并且P-loop上氨基酸残基的突变会导致酶活丧失,因此结合结构分析和体外酶活实验,本论文认为PDRP的激酶和焦磷酸酶活性中心均位于CTD内。进一步通过与P-loop核酸结合蛋白激酶超家族的HprK/Ps蛋白结构比对显示PDRP的激酶和焦磷酸酶共用同一个酶活中心,同时揭示了 PDRP的激酶和焦磷酸酶催化机制:P-loop结合ADP或磷酸根离子,Lys274和Lys299中和磷酸基团负电荷,Asp277质子化或去质子化PPDK苏氨酸残基进而启动亲核攻击,完成焦磷酸酶或激酶反应。基于结构分析的定点突变实验表明酶活中心关键氨基酸残基的突变会导致酶活丧失进一步证实了该催化机制。本论文为了解PDRP催化机制提供了结构依据,为指明PDRP与其它双功能酶的进化关系提供新的科学证据,同时NTD独特的结构特征为设计调节PDRP与PPDK相互作用进而控制光合作用的选择性激动剂或抑制剂提供了结构基础。