第一部分高果糖诱导大鼠胰岛素抵抗合并高血压和高甘油三酯血症 研究背景与目的：Hwang等首次报道高果糖饮食可以诱导大鼠产生高血压。Zavarom和Tobey等研究发现，高果糖饮食也能引起大鼠产生胰岛素抵抗和高甘油三酯血症。在确定果糖产生此效应试验中，35-72％果糖饮食或者饮用10-15％果糖溶液诱导大鼠两周以上均可以产生胰岛素抵抗合并高血压，高甘油三酯血症。本部分试验主要在于使用高果糖饮食制作大鼠胰岛素抵抗合并高血压，高甘油三酯血症模型。 方法：雄性SD大鼠(30只)室温驯养一周，随机分为高果糖饮食组(12只)和正常饮食组(18只)。果糖饮食组食用标准饲料和饮用15％的果糖溶液，正常饮食组食用标准饲料和自来水。每周测量血压一次，试验组和对照组大鼠第三周采取尾静脉血液并分离血清，留取大鼠24小时尿液。采用临床标准方法测定血脂，血胰岛素，血糖浓度。胰岛素抵抗指数(IR)按内环境稳态模型技术(HOMA)计算。各项指标采用SPSS统计软件ANOVA统计分析，参数以均数±标准差表示。 结果：果糖诱导3周后，果糖饮食组大鼠血压明显高于正常饮食组(135.5±0.6和119.4±0.7，P＜0.001)；果糖饮食组大鼠血胰岛素及甘油三酯明显升高，与正常饮食组比较有显著性差异(P＜0.05)。 结论：高果糖饮食可以引起大鼠胰岛素抵抗和高血压，高甘油三酯血症。果糖诱导的大鼠代谢综合症是较为理想的代谢综合症动物模型之一。 第二部分CYP450-2J3基因的克隆及其在293细胞的表达 研究背景与目的：花生四烯酸细胞色素P450(ArachidonicAcidCytochromeP450，CYP450)表氧化酶代谢产物表氧化二十碳三烯酸(EpoxyeicosatrienoicAcids，EETs)是继一氧化氮(NO)和前列环素(PGI2)之后发现的又一种重要血管舒张因子。早期的研究发现，它通过激活钙离子敏感的钾通道，使平滑肌细胞处于超极化状态而扩张血管，而被认为是内皮源性超极化因子(Endothelium-DerivedHyperpolaringFactor，EDHF)。内皮来源的EETs也同样可以激活K+Ca通道使平滑肌细胞超极化产生血管舒张效应，这种类似的效应使研究人员怀疑EETs和EDHF是同一种物质。花生四烯酸经细胞色素P450(CytochromeP450，CYP450)表氧化酶代谢为四种EETs，分别为：5,6-EET、8,9-EET、11，12-EET和14,15-EET。细胞色素P450表氧化酶能够以氧化和依赖NADPH的方式氧化、过氧化和/或者还原胆固醇、维生素、类固醇与多种药物。大鼠CYP2J3基因编码的是分子量为57，969Da的末端含有亚铁血红素的细胞色素P450表氧化酶，属于细胞色素P450超家族成员。这些细胞色素P450同工酶，如CYP2J2，CYP2J3能代谢花生四烯酸(arachidonicacid，AA)生成EETs。而这些化学物质，在调节血压，舒张血管，调节细胞增值，炎症，参与细胞信号转导方面都起着重要作用。 我们采用RT-PCR和OE-PCR技术成功克隆出CYP2J3基因，并将其亚克隆入pCDNA3.1(+)真核表达载体，pCDNA3.1(+)-CYP2J3重组质粒的成功构建，并在293细胞稳定有效表达。为研究CYP2J3蛋白的结构和功能奠定了基础。我们研究CYP450对于心血管系统保护的实验研究在此基础上进行。 方法：提取大鼠肝脏组织总RNA，采用RT-PCR扩增出CYP2J3基因两个片断CYP2J3-A和CYP2J3-B，运用重叠延伸聚合酶链反应(OE-PCR)扩增大鼠CYP2J3基因ORF全长，经过酶切坚定和测序正确后，亚克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+)。经脂质体转染293细胞，用WesternBlotting鉴定其在293细胞有效表达。 结果：RT-PCR成功克隆出CYP2J3-A和CYP2J3-B两片段；运用重叠延伸PCR扩增出CYP2J3基因开放式阅读框(ORF)全长序列，测序结果显示获得ORF全长序列；pCDNA3.1(+)-CYP2J3的成功构建，然后通过脂质体转染293细胞，试验结果表明，CYP2J3基因能在293细胞稳定有效表达。 结论：大鼠CYP2J3基因的成功克隆以及pCDNA3.1(+)-CYP2J3载体的成功构建。为CYP2J3基因的功能研究和相关疾病的研究提供了可行的工具。 第三部分CYP2J3基因降低果糖诱导的大鼠高血压并改善胰岛素抵抗 研究背景与目的：最近的国内外临床观察发现，高血压患者常伴有胰岛素抵抗甚至糖尿病，我们用高果糖溶液诱导出了高血压伴有胰岛素抵抗的大鼠模型。实验大鼠血压较对照组明显升高(135.5±0.6和119.4±0.7，P＜0.001)；而血甘油三酯和胰岛素水平也显著升高，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；实验大鼠IR(HOMA)也明显高于对照组(2.4±0.2和1.8±0.1，P＜0.05)；两组血糖和胆固醇浓度无统计学差异。以上结果显示，高果糖诱导三周可以导致大鼠出现明显的血压升高及高胰岛素血症，并产生胰岛素抵抗。 最近的研究发现，高果糖诱导动物模型的高血压与交感神经活性增加及内皮素系统紊乱有关。EETs目前被认为就是一种EDHF，通过激活K+Ca通道使平滑肌细胞超极化产生血管舒张效应，从而调节血管张力降低血压。有试验表明，CYP2J3和CYP2J2都可以代谢花生四烯酸生成EETs，而EETs能舒张血管并降低大鼠血压。这些结果表明内源性和外源性的EETs水平影响着血管张力并与血压的调节密切相关。本试验主要探讨CYP2J3基因干预能否降低高果糖诱导大鼠的高血压，以及高血压大鼠的胰岛素水平，从而改善胰岛素抵抗。 方法：雄性SD大鼠饮用15％的果糖溶液诱导成高血压和胰岛素抵抗模型，经尾静脉注入pCDNA3.1-CYP2J3基因。大鼠血压测量仪测量血压，每周一次。果糖诱导第三周及基因注入后第二周分别留取大鼠尾静脉血及24小时尿标本，采用临床标准方法测定血脂，血胰岛素，血糖浓度。胰岛素抵抗指数(IR)按内环境稳态模型技术(HOMA)计算。 结果：高果糖诱导三周后，试验组大鼠血压和胰岛素均明显高于对照组(P＜0.05)。此后，在尾静脉注入pCDNA3.1(+)-CYP2J3基因高血压试验组第七天即可测量到果糖诱导的大鼠血压降低，最大降压效应在注射基因二周后，降压效应持续三周以上。并在血压下降的同时，胰岛素抵抗得到明显改善。 结论：高果糖饮食可以诱导大鼠高血压和胰岛素抵抗，CYP2J3基因导入后可以降低果糖诱导大鼠的血压并改善胰岛素的抵抗，结果显示CYP2J3基因治疗高血压合并胰岛素抵抗的可行性。