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第一章hPPARα基因载体构建及其高效转染表达体系的建立目的:克隆人过氧化物酶体增殖物激活受体α基因(hPPARα),构建真核细胞表达载体phPPARα-IRES2-EGFP,转染293细胞并检测转染细胞hPPARα表达水平,以建立其高效转染表达体系,为进一步研究PPARα功能和建立基于PPARα为靶点的药物筛选分子平台奠定基础。方法:采用逆转录法(RT)从HepG2细胞总RNA中获得hPPARαcDNA全长序列,再用分别带有BamHI和SalI酶切位点的hPPARα基因扩增上、下游引物,经PCR扩增获得hPPARα基因。用BamH I和Sal I双酶切消化载体pIRES2-EGFP和PCR产物,胶回收后进行hPPARα与pIRES2-EGFP连接,构建含hPPARα基因的重组质粒phPPARα-IRES2-EGFP。重组质粒经CaCl2法转化DH5α感受态细胞,卡那霉素筛选阳性克隆,并用BamH I和Sal I双酶切及测序鉴定重组质粒phPPARα-IRES2-EGFP中插入的hPPARα基因的完整性和忠实性。重组质粒phPPARα-IRES2- EGFP转染293细胞,荧光显微镜观察GFP报告基因表达强度和转染效率,并对转染细胞的hPPARα基因表达进行荧光定量PCR、免疫细胞化学和Western blot检测。结果:从HepG2细胞总RNA中经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到1520 bp预期片段大小的hPPARαcDNA全长序列。重组质粒phPPARα-IRES2-EGFP经酶切及测序鉴定,其插入的hPPARα基因序列与GeneBank数据库提交的相应序列(NM001001928/gi:61744437)完全吻合。phPPARα-IRES2-EGFP转染的293细胞,其GFP报告基因表达强,转染效率高达83±9%;重组质粒转染的293细胞hPPARαmRNA表达水平比空载体pIRES2-EGFP转染组高3个数量级,提示导入的重组质粒能够在mRNA水平高效表达hPPARα;免疫细胞化学和western blot检测表明,转染phPPARα-IRES2-EGFP的293细胞高表达hPPARα蛋白。结论:成功克隆了hPPARα基因全长cDNA序列,构建了含hPPARα基因的真核表达载体phPPARα-IRES2-EGFP;并在转染的293细胞中获得hPPARα基因的高效表达;建立了phPPARα-IRES2-EGFP重组质粒体外高效转染表达体系。这为进一步研究PPARα受体功能和建立基于PPARα受体靶点的药物筛选分子平台奠定了基础。第二章hPPARδ基因载体构建及其高效转染表达体系的建立目的:克隆人过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因(hPPARδ),构建真核细胞表达载体phPPARδ-IRES2-EGFP,转染293细胞并检测转染细胞中hPPARδ的表达水平,以建立phPPARδ-IRES2-EGFP载体高效转染表达体系,为进一步研究PPARδ受体功能和建立基于PPARδ为靶点的药物筛选分子平台奠定基础。方法:以hPPARδ基因全长cDNA为模版,设计分别带有BamH I和Sal I酶切位点的hPPARδ基因扩增上、下游引物,采用RT-PCR法自HepG2细胞总RNA中获得含hPPARδ全长基因编码序列。用BamH I和Sal I双酶切消化载体pIRES2-EGFP和RT-PCR产物,胶回收后对2者进行连接,构建含hPPARδ基因的载体phPPARδ-IRES2-EGFP;重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP转化DH5α感受态细胞,卡那霉素筛选阳性克隆,分别对挑选的阳性克隆用BamH I和Sal I双酶切及测序,以鉴定重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP中插入的hPPARδ序列的完整性和可靠性。重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP转染293细胞,荧光显微镜观察报告基因GFP表达强度和转染效率,并对转染细胞的hPPARδ基因表达进行荧光定量PCR、免疫细胞化学和Western blot检测。结果:采用RT-PCR从HepG2细胞总RNA中扩增得到1436 bp预期片段大小的hPPARδcDNA全长序列,重组质粒phPPARδ-IRES2- EGFP经酶切及测序鉴定,其插入的hPPARδ序列与GeneBank数据库中提交的相应序列( AY919140/gi:60115374 )完全吻合。phPPARδ-IRES2-EGFP转染的293细胞,其GFP报告基因表达强,转染效率高达85±10%;转染细胞hPPARδmRNA表达水平比空载体转染对照组高3个数量级,提示导入的重组质粒能够在mRNA水平高效表达hPPARδ;免疫细胞化学和Western blot检测均表明,转染phPPARδ-IRES2-EGFP的293细胞高表达hPPARδ蛋白。结论:成功的克隆了hPPARδ基因,构建了含hPPARδ真核表达载体phPPARδ-IRES2-EGFP;并在转染的293细胞中获得了hPPARδ高效表达,建立了phPPARδ-IRES2-EGFP重组质粒体外高效转染表达体系。这为进一步研究PPARδ受体功能和基于PPARδ受体靶点的药物筛选分子平台的建立奠定了基础。第三章hPPARγ1基因载体构建及其高效转染表达体系的建立目的:克隆人过氧化物酶体增殖物激活受体γ1基因(hPPARγ1),构建真核细胞表达载体phPPARγ1-IRES2-EGFP,转染293细胞并检测转染293细胞中hPPARγ1表达水平,以建立其高效转染表达体系,为进一步研究PPARγ1受体功能和基于PPARγ1受体靶点的药物筛选分子平台的建立奠定基础。方法:设计分别带有Xho I和Sma I酶切位点的hPPARγ1基因扩增上、下游引物,采用RT-PCR法自HepG2细胞总RNA中获得含hPPARγ1基因全长编码序列。用Xho I和Sma I双酶切载体pIRES2-EGFP和RT-PCR产物,胶回收后对2者进行连接,构建含hPPARγ1基因的重组质粒phPPARγ1-IRES2-EGFP;重组质粒转化DH5α感受态细胞,卡那霉素抗性筛选阳性克隆。用Xho I和Sma I双酶切筛选的阳性克隆质粒,并测序鉴定重组质粒phPPARγ1-IRES2-EGFP中插入的hPPARγ1的完整性和可靠性。重组质粒phPPARγ1-IRES2-EGFP转染293细胞,荧光显微镜观察GFP报告基因表达强度和转染效率,并对转染细胞的hPPARγ1基因表达进行荧光定量PCR、免疫细胞化学和western blot检测。结果:从HepG2细胞总RNA中经RT-PCR获得1520 bp预期片段大小的hPPARγ1全长序列。重组质粒phPPARγ1-IRES2-EGFP经酶切及测序鉴定,其插入的hPPARγ1基因序列与GeneBank数据库中提交的相应序列( NM005037/gi:62865855, NM138711/gi:62865854, NM138712/gi:62865852)完全吻合。重组质粒转染的293细胞,其GFP报告基因表达强,转染效率高达83±11%;转染的293细胞hPPARγ1 mRNA表达水平比空载体转染对照组高3个数量级,提示导入的重组质粒能够在mRNA水平高效表达hPPARγ1;免疫细胞化学和western blot检测均表明,转染phPPARγ1-IRES2-EGFP的293细胞高表达hPPARγ1蛋白。结论:成功克隆了hPPARγ1基因,构建了含hPPARγ1真核表达载体phPPARγ1-IRES2-EGFP;并在转染的293细胞中获得hPPARγ1基因的高效表达,建立了phPPARγ1-IRES2-EGFP体外高效转染表达体系。这为进一步研究PPARγ1受体功能和建立基于PPARγ1为靶点的药物筛选分子平台奠定了基础。第四章小檗碱抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长与PPARγ受体的关系目的:研究小檗碱和罗格列酮对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231体外生长的影响及其与PPARγ受体的关系,以评价其在人乳腺癌治疗上的应用潜力。方法:采用噻唑蓝(MTT)法,分析不同浓度(1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4 mol/L)和不同作用时间下小檗碱和罗格列酮对MDA-MB-231细胞的体外生长抑制效应;结合PPARγ拮抗剂GW9662,研究小檗碱和罗格列酮对MDA-MB-231细胞增殖的影响与PPARγ受体激动的关系;流式细胞仪检测罗格列酮干预后MDA-MB-231细胞周期变化和细胞凋亡情况;并用TUNEL法,对小檗碱和罗格列酮作用后的MDA-MB-231细胞凋亡情况进行原位检测。结果:小檗碱和罗格列酮可抑制MDA-MB-231细胞的生长,并呈明显的量-效和时-效关系,小檗碱和罗格列酮干预MDA-MB-231细胞24 h的半数抑制浓度(IC50)分别为0.21和4.3μmol/L;PPARγ受体拮抗剂GW9662可部分逆转罗格列酮对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用(P<0.05),但不能逆转小檗碱的相应作用;随着罗格列酮使用浓度的增高,MDA-MB-231细胞G0/G1期细胞比例逐步上升,而S期比例逐步下降;高浓度罗格列酮(100μmol/L)还可诱导MDA-MB-231细胞凋亡,TUNEL法检测的凋亡发生率18.4±3.1%与Annexin V-FITC法检测的结果一致(16.6±2.7%)(P>0.05)。而小檗碱诱导MDA-MB-231细胞凋亡作用则更为明显,TUNEL法检测1×10-6、1×10-5和1×10-4 mol/L小檗碱干预MDA-MB-231细胞的凋亡发生率分别为17.7±3.2%、59.3±4.5%和89.6±5.7%。结论:小檗碱和罗格列酮均能明显抑制MDA-MB-231细胞生长,但与罗格列酮不同,前者的作用不通过PPARγ受体介导。罗格列酮可使MDA-MB-231细胞阻滞于G1期,高浓度时还可诱导其发生凋亡,而小檗碱诱导MDA-MB-231细胞凋亡的效应则更为显著。小檗碱和罗格列酮均有望成为治疗乳腺癌的有效药物。