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目的：角膜移植是目前最成功的器官移植手术，是治疗不可逆角膜盲的最重要手段，但是移植排斥反应仍是导致角膜移植失败的首要原因。深入了解角膜移植排斥反应发生的机理并予以有效治疗，对于提高角膜移植手术成功率、恢复患者视力具有重要意义。近年来，树突状细胞(dendritic cells,DCs)被发现在免疫系统中扮演着双重角色，除作为抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC)诱发免疫反应外，还能诱导中枢或周围性免疫耐受。利用不成熟或表达抑制性细胞因子的DCs诱导免疫耐受，为治疗器官移植排斥反应提供了新的策略。本研究的目的是了解DCs在体外的生理功能特点及眼内、皮下注射后的体内迁移情况；探讨小鼠同种异体角膜移植排斥反应发生的机制及不同类型树突状细胞在角膜移植排斥反应中的免疫调节作用。 方法： 1．小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow derived dendritic cell,BMDC)，在含5％粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulation factor,GM-CSF)的RPMl1640完全培养液中(含或不含0.2ng／ml TGFβ2)培养5d，通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)和免疫荧光化学染色鉴定DCs的表型；通过混合淋巴细胞反应(mixed lymphocytes reaction,MLR)检测DC、TGFβ2-DC刺 第四军医大学博士学位论文 激同种异体T细胞增殖的能力。CD4”T细胞与自体或同种异体DC、 TGFBZ－DC共培养 sd后，采用 MLR、FCM方法检测 CD4”T细胞的增 殖能力和表型。 2．培养 sd的 BMDC用 PKHZ－GL（绿色荧光染料）标记，PBS（对照组）和卜 10‘PKHZ．GL标记的 DCS分别注入同品系小鼠右眼结膜下（subcofljunctlval，s．com．）或右狈颈部皮下（subcutaneous，s．c．），24h。48h后分 U收集颈部颌下淋巴结（submandibular lymph node，S皿N）和颈浅淋巴结（superficial cervical lymph node，SCLN）。通过共聚焦显微镜观察或FCM分析，分别检测淋巴结切片、淋巳细胞中的标记DCs。 3．建立小鼠角膜移植模型，不同时间点对术眼进行临床观察、免疫荧光化学染色。移植后3d，采用三色流式细胞术分析SMLN和 SCLN内的淋巴细胞表型。 4．将实验动物分为 3组，I组动物分别给予 PBS（la），自体 DC（foX同种异体 DC厂CV人．注射；11组动物分别给予PBS＊，自体 DC＊IbX自体 TGFBZ－DC （ilo s．c．注射；Ill组动物分别给予 PBS （llla，自体 DCs＊ X 自体 TGFBZ－DC＊ C．COul．注射。第一次注射后 7d，一部分动物通过MLR检测SMLN和SCLN中淋巴细胞的增殖情况；并收集MLR培养液上清，用ELISA方法检测淋巴细胞分泌的细胞因于浓度；另一部分动物进行同种异体角膜移植。移植后3d，通过FCM分析SMLN和SCLN中淋巳细胞表型的变化，并在术后不同时间点对术眼进行临床观察。 结果： 1．BMDC是CDllc”””，CD86＋“，MH C class II＋，CD8a”的髓系DC。TGFBZ作用抑制了DC表面协同刺激因子的表达，CD86由2475％下降至门％；NlllC class 11表达也从 87％下降至 4．9％。TGFBZ作用后，DCs刺激同种异体T细胞增殖的能力显著下降（P＜001）。在与同种异体脾细 4 第四军医大学博士学位论文 胞反应的MLR中，自体TGFBZ－DC诱导后，CD4丫细胞增殖反应较自 体DC诱导增强；而同种异体TGF02－DC诱导后，CD4”T细胞增殖反应 较同种异体DC诱导减弱。与初始型T细胞相比，被DC激活的CD4”T 细胞CD69表达下降，CD25、CD28表达上升。与同种异体DC诱导相 比，同种异体 TGFDZ－DC诱导后，CD4”T细胞 CDISZ表达由 15．30上升 至223％。 2．标记DC结膜下注射后24h、48h，仅在注射侧SMLN内可观察 到标记 DC：皮下注射后 48h，双侧 SCLN内可观察到标记 DC，但 SMLN 内未见。通过FCM分析，结膜下或皮下注射卜10‘细胞后48h，约有］叫0’ 的标记DC到达相应引流淋巴结。 3．角膜移植术后6h，中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞开始聚集 并逐渐浸润植片；24h时 CD4＊细胞和 CDS“T细胞出现并侵入植片，二 周时达到高峰：术后12d～21d所有植片均被排斥。移植后3d gALN内 CD4”T细胞比例由正常的50．66O下降至39．030（P＜0．05），而SCLN各 细胞比例无明显变化。 4．（l）MLR PBS、DC第一次注射后 7d，检测受体 SMLN和 SCLN 的 NThR反应。PBS S．C或S．COflj注射后 S皿N和 SCLN内淋巴细胞无增 殖反应。DC SC注射后双侧 SCLN内可见强增殖反应，而 DC SCOflj注射 后仅在右侧 SMLN内可见强增殖反应。与自体 DC s。注射相比，同种异