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研究目的卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指因卵巢储备功能下降而导致的妇女40岁之前闭经,并伴有低雌激素和高促性腺激素的疾病。卵巢早衰的病因非常复杂,遗传、自身免疫性疾病、医源性损伤、放疗和化疗对性腺的破坏等,都可能是引起卵巢功能衰竭的原因。近几年对卵巢早衰的治疗,临床上多用激素替代治疗、卵巢移植技术、免疫疗法、基因疗法、心理疗法等方法。但由于卵巢早衰病因比较复杂,其具体发病机制还不明确而导致治疗效果并不尽如人意。卵巢早衰严重影响了患者的精神健康和生活质量。如何减缓卵巢功能衰退的速度,改善甚至恢复卵巢的初始功能,提高患者生活质量,满足患者生育要求,是目前医学领域中探讨的热点和难点。顺铂(cisplatin,CDDP)是一种用来治疗多种肿瘤的化疗药物。有研究表明,顺铂的使用对卵巢功能有着直接的不良作用,可诱导卵巢颗粒细胞的凋亡,最终形成卵巢早衰。近年来关于癌症化疗药物导致卵巢雌激素分泌水平下降,甚至形成卵巢早衰的报道日益增多。西医对卵巢早衰多采取激素替代疗法,但副作用明显,所以中医药在治疗卵巢早衰中越来越凸显出其独特的优势。现代药理研究表明,四物合剂即四物汤中成药,在生物体内参与多项重要生命活动,表现出抗贫血、保护心血管功能、增强免疫力、抗氧化、抗衰老等多方面的药理效应,特别是对多个靶器官表现出抗突变和抗药物毒性的作用。四物合剂药理作用靶点和途径的揭示将为其临床应用提供重要的实验依据。人类细胞色素蛋白P450芳香化酶是E2(Estradiol,雌二醇)合成的关键限速酶,Cyp19a1是芳香化酶的编码基因,它在E2的分泌中起到了非常重要的作用。相关研究表明雌二醇的合成和分泌与TGFβ-Smads信号转导通路有关,而Smad2/3蛋白则是该信号转导通路的关键信号传导分子。本研究拟通过顺铂损伤大鼠卵巢颗粒细胞建立顺铂损伤型卵巢早衰模型,基于TGFβ3通路检测四物合剂药理血清对卵巢颗粒细胞增殖、E2分泌水平、Cyp19a1基因及其调控蛋白Smad2/3表达的影响,探究四物合剂药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞芳香化酶活性和表达的干预机制。研究方法1.MTT法观察四物合剂药理血清对顺铂损伤颗粒细胞增殖的影响;2.放射免疫法测定四物合剂药理血清对顺铂损伤颗粒细胞E2分泌水平的影响,以反映四物合剂对Cyp19a1活性的影响;3.蛋白印迹法检测四物合剂药理血清对顺铂损伤颗粒细胞Cyp19a1及其调控蛋白Smad2/3、Psma2/3表达水平的影响;4.免疫组化法检测四物合剂药理血清对顺铂损伤颗粒细胞Cyp19a1及其调控蛋白Smad2/3、Psmad2/3的影响;同时加入TGFβ3分别测定四物合剂作用下Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3蛋白表达水平的变化;5.加入TGFβ-Smad通路阻断剂SB431542,通过放免法测定E2水平,免疫组化法测定Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3 表达水平的变化。研究结果1.四物合剂药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞增殖的影响:与生理对照组相比,顺铂损伤后细胞增殖能力减弱;阳性组,四物合剂各剂量药理血清组作用后,颗粒细胞增殖能力增强,四物合剂组中以大剂量组作用最为显著。2.四物合剂药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞E2分泌的影响:顺铂损伤颗粒细胞后,E2分泌水平下降;模型组相比,四物合剂各剂量药理血清组中E2分泌水平升高,以大剂量组作用最为显著。3.四物合剂药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞Cyp19a1基因及其调控蛋白Smad2/3、Psma2/3表达的影响:蛋白印迹结果显示,顺铂作用后,模型组Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3相对表达量均较生理对照组降低;在四物合剂药理血清组作用后,三者表达量均较模型组提升明显,其中以四物合剂大剂量组效果较为显著。4.加入TGFβ3后四物合剂药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞Cyp19a1及其调控蛋白Smad2/3、Psamd2/3 表达的影响:免疫组化结果显示:顺铂可以抑制Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3蛋白的表达,四物合剂药理血清作用后,三者的表达量均较模型组上升。在四物合剂药理血清的干预过程中,加TGFβ3各药理血清组与不加TGFβ3对应组相比,Cyp19a1、Smad2/3、Psamd2/3表达水平均有所升高。5.加入TGFβ-Smad通路阻断剂SB431542后四物合剂药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞E2分泌水平,Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3表达水平的影响:(1)放免法结果显示:在四物合剂药理血清的干预过程中,加入通路阻断剂SB431542后,E2分泌水平较无阻断剂组显著降低。(2)免疫组化法结果显示:在四物合剂药理血清的干预过程中,加阻断剂SB431542各组与对应不加阻断剂各组相比,Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3的表达均显著降低。结论1.四物合剂药理血清可以促进顺铂损伤后颗粒细胞的增殖和分泌功能。2.四物合剂药理血清通过上调Cyp19a1基因调控蛋白Smad2/3、Psmad2/3的表达,进而上调Cyp19a1基因的活性与表达,最终实现其对顺铂损伤卵巢颗粒细胞的修复作用。3.四物合剂药理血清对顺铂损伤卵巢颗粒细胞的改善作用很可能通过TGFβ3-Smad2/3信号转导通路实现。