论文部分内容阅读
研究背景:肝脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是肝脏手术常见的生理变化,大量研究证实,肝脏I/R损伤是肝脏手术后肝脏功能低下、肝淤血、进行性血栓形成及移植物无功能等并发症的主要原因。同时,由于缺氧/复氧过程中,细胞内活性氧的形成、淋巴细胞和中性粒细胞的活化等严重损害肝细胞,继而导致炎症的发生乃至细胞的凋亡。新近研究发现,在肝脏手术后,由肝脏I/R造成的死亡率明显上升,然而由于其复杂的生理生化过程,目前尚无统一有效的预防和治疗方法。因此,寻找合适的药物,有效控制肝脏I/R损伤是当今医学界的一大热点和难点。丙泊酚(Propofol)是一种新型快速短效的静脉麻醉药,其临床特点是起效快、持续时间短、苏醒迅速而平稳,不良反应少,现已广泛应用于临床各科手术麻醉。近年来,越来越多的研究证明丙泊酚在肝脏I/R损伤中起到保护作用,然而其具体保护机制尚未阐明。有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族,其级联反应是通过改变蛋白质的磷酸化水平将信号从细胞外转到细胞内,并向下游传递。MAPKs参与机体内氧化应激反应,其通过将受体接受的胞外信号转入细胞核,参与调控基因的表达、细胞的生长、发育、分化和凋亡等一系列生理过程。近年来,越来越多的证据表明,MAPK信号通路参与机体内一系列I/R过程,并且可能引起组织器官结构和功能的改变。有丝分裂原激活蛋白激酶 6(mitogen-activated protein kinase 6,MAPK6)是 MAPK 家族的重要成员之一,其表达上调显著增加细胞的凋亡,参与肝癌的发生和发展过程。然而,MAPK6在肝脏I/R中的作用待进一步研究。MicroRNA(miRNA)是一类非编码小RNA,长度大约为22个核苷酸。MiRNA在生物进化中比较保守,从低等生物如细菌,病毒等到动植物的基因组中均有存在。研究证实,miRNA广泛参与基因的表达调节,及细胞生长、分化、凋亡等重要的生命活动,是生物体内一种重要的调节手段。已有研究发现多种miRNA参与肝脏I/R损伤,其中miR-133a被证实是一个与I/R损伤密切相关的miRNA。MiR-133a可以通过靶向调控死亡相关蛋白激酶2(death associated protein kinase 2,DAPK2)进而抑制心肌细胞的凋亡,发挥对I/R心肌的保护作用。同时,miR-133a-5p也被证实可通过靶向调控DAPK2蛋白抑制I/R引起的心肌细胞凋亡。此外,miR-133a-5p还可通过靶向FSCN1抑制肝癌细胞增殖和迁移,增加肝癌细胞凋亡。然而,miR-133a-5p在肝脏I/R损伤中的作用尚未阐明。本文通过通过生物学软件预测发现,miR-133a-5p与MAPK6 3’UTR区存在结合位点,表明MAPK6可能是miR-133a-5p的下游调控靶分子之一。基于以上背景,本研究首先丙泊酚预处理待建模型大鼠,然后建立肝脏I/R大鼠模型,利用全自动生化分析仪检测肝脏损伤标记物水平,同时利用qRT-PCR和western blot进一步检测病大鼠肝脏组织中MAPK6和miR-133a-5P的表达;其次建立肝细胞缺氧/复氧模型,进一步探讨丙泊酚在肝脏细胞H/R损伤保护中的分子机制;最后通过大鼠肝脏I/R在体实验进一步验证丙泊酚在肝脏I/R损伤的保护作用及潜在机制。本文旨在进一步阐释丙泊酚对肝脏I/R损伤的保护作用机制,为丙泊酚的临床应用提供实验基础和理论指导。研究内容分为3部分:第一部分:丙泊酚在大鼠肝脏I/R损伤中的保护作用及其对miR-133a-5p和MAPK6表达的影响目的:观察丙泊酚对大鼠肝脏I/R损伤的保护效应及其对miR-133a-5p和MAPK6表达的调控。方法:1.丙泊酚预处理大鼠,构建大鼠肝脏I/R损伤模型,收集假手术组、I/R组和丙泊酚干预组大鼠血清,全自动生化分析仪直接检测血清中AST和ALT的水平。2.处死所有实验大鼠,取肝脏组织后,qRT-PCR检测组织中miR-133a-5p和MAPK6 mRNA的表达水平;western blot检测肝脏组织中MAPK6蛋白表达水平。3.人正常肝细胞QSG-7701培养于含有10%FBS和1%双抗的RPMI-1640培养基中,缺氧/复氧组先后给予缺氧和复氧处理。4.细胞处理完成后,qRT-PCR检测细胞中miR-133a-5p和MAPK6mRNA的表达水平;western blot检测肝细胞中MAPK6蛋白表达水平。结果:1.与假手术组大鼠相比,肝脏I/R损伤模型大鼠AST和ALT的血清水平显著升高;而丙泊酚干预组模型大鼠血清中AST和ALT的水平显著低于肝脏I/R损伤模型大鼠。2.肝脏I/R可显著抑制大鼠肝组织中miR-133a-5p表达,而丙泊酚预处理可显著上调其表达;MAPK6在I/R损伤的肝脏组织中表达显著升高,而丙泊酚预处理显著抑制MAPK6在I/R模型肝脏组织中的表达;3.缺氧/复氧处理导致肝细胞中miR-133a-5p表达显著降低,但MAPK6的mRNA和蛋白表达水平显著升高。与缺氧/复氧处理组相比,缺氧/复氧和丙泊酚预处理显著上调miR-133a-5p表达并抑制MAPK6的mRNA和蛋白表达。结论:1.丙泊酚预处理可显著降低肝脏I/R模型大鼠AST和ALT的血清水平,进而保护肝脏I/R损伤。2.肝脏I/R模型大鼠肝脏组织中miR-133a-5p表达降低而MAPK6表达显著升高;丙泊酚预处理上调了模型大鼠肝脏组织中miR-133a-5p表达同时下调了MAPK6表达。3.建立正常肝细胞QSG-7701病理模型,缺氧/复氧处理引起细胞中miR-133a-5p表达降低而MAPK6表达升高;丙泊酚预处理细胞逆转了缺氧/复氧对肝细胞的作用,同时伴随着miR-133a-5p表达升高,MAPK6表达降低。第二部分:丙泊酚在缺氧/复氧诱导肝细胞凋亡中的作用及其调控miR-133a-5p/MAPK6表达的机制研究目的:细胞水平探讨丙泊酚对肝脏I/R损伤保护作用的分子机制。方法:1.生物信息学软件分析miR-133a-5p与MAPK的序列关系;取MAPK6 3’UTR部分构建荧光载体,转入肝细胞,双荧光素酶报告基因法鉴定miR-133a-5p与MAPK的调控关系。2.分别构建miR-133a-5p过表达载体和抑制表达载体,并转染肝细胞,real-time PCR和western blot检测细胞中MAPK6 的表达。3.建立肝细胞缺氧/复氧模型,并转染miR-133a-5p过表达载体,qRT-PCR和western blot检测MAPK6 的表达。4.建立肝细胞缺氧/复氧模型,在缺氧/复氧处理前进行丙泊酚预处理,同时构建miR-133a-5p抑制表达载体并转染细胞,qRT-PCR和western blot检测MAPK6的表达。5.建立肝细胞缺氧/复氧模型,在缺氧/复氧处理前利用丙泊酚处理,同时构建MAPK过表达表达载体并转染细胞,TUNEL检测细胞凋亡水平。结果:1.MiR-133a-5p负调控MAPK6的表达,过表达miR-133a-5p显著下调MAPK6的mRNA和蛋白水平的表达,干扰miR-133a-5p显著上调MAPK6的mRNA和蛋白水平的表达。2.肝细胞缺氧/复氧处理显著上调MAPK6的表达,而过表达miR-133a-5p显著逆转了该结果。3.丙泊酚预处理显著抑制了缺氧/复氧引起的肝细胞中MAPK6表达的上调,而干扰miR-133a-5p消除了丙泊酚对MAPK6表达的影响;4.缺氧/复氧显著增加了肝细胞的凋亡,丙泊酚预处理抑制了缺氧/复氧诱发的肝细胞凋亡,而过表达MAPK6消除了丙泊酚对肝细胞的保护作用。结论:丙泊酚预处理通过上调miR-133a-5p抑制MAPK6表达进而抑制了缺氧/复氧诱发的肝细胞凋亡。第三部分:抑制miR-133a-5p对丙泊酚缓解大鼠肝脏I/R损伤影响的观察目的:体内实验验证丙泊酚在肝脏I/R损伤中的保护作用机制。方法:1.实验分组为肝脏I/R组(HI/R)、肝脏I/R+丙泊酚组(HI/R+propofol)、肝脏 I/R+ 丙泊酚 +NC 组(HI/R+propofol+NC)、肝脏 I/R+ 丙泊酚 +miR-133a-5p inhibitor组,全自动生化分析仪直接检测不同处理组大鼠AST和ALT的血清水平;2.取上述实验中所有大鼠的肝脏组织,qRT-PCR和western blot检测肝脏组织中MAPK6 mRNA和蛋白的表达水平。结果:1.肝脏I/R大鼠血清中ALT和AST的水平显著上调,丙泊酚预处理下调了ALT和AST水平,而miR-133a-5p inhibitor取消了丙泊酚对肝脏损伤的保护作用。2.大鼠肝脏缺血再灌组大鼠MAPK6的表达水平显著上调,丙泊酚预处理下调了 MAPK6的表达水平,而miR-133a-5p inhibitor取消了丙泊酚对损伤肝组织中MAPK6表达的影响。结论:体内实验证实丙泊酚通过miR-133a-5p调节MAPK6进而在大鼠肝脏I/R损伤中发挥保护作用。综上所述,本研究深入探讨了丙泊酸在肝脏I/R损伤中的保护作用及相关分子机制,在明确肝脏I/R中miR-133a-5p表达下调,MAPK6表达上调的基础上,揭示了 miR-133a-5p与MAPK6参与丙泊酚在肝脏I/R损伤中的保护作用机制。另外本实验从体内和体外两部分实验证实了丙泊酚的保护机制,该研究为今后肝脏I/R的预防及治疗起到重要的指导作用。