三桠苦Melicope pteleifolia(Champion ex Bentham)T.G.Hartlry 为芸香科的一种常绿小乔木植物,主要分布在华南地区,常用于城市和园林绿化。三桠苦的干燥茎及带叶嫩枝是岭南地区的一种常用中药(中药名:三叉苦)。三叉苦味苦、性寒,归心、肝经,具有清热解毒、祛风除湿和消肿止痛等多种功效,临床上主要用于治疗感冒发热、扁桃体炎、咽喉炎、黄疸型肝炎、胃脘疼痛、疟疾、风湿痹痛、跌打肿痛、湿疹、皮炎和痔疮等症。此外,三叉苦也是广东凉茶、三九感冒灵和三九胃泰等中成药的重要原料。三桠苦的分布地区较广泛,但是大多呈零星分布,而市场需求巨大,其野生资源日益匮乏。目前,已有不少企业开始对三桠苦进行规模化种植,以填补市场需求的缺口。由于三桠苦种子量大易得,大部分企业主要采用种子繁殖方式进行育苗。但在实际生产中发现,三桠苦种子的发芽率极低。为提高种子繁殖效率,降低育苗成本,本课题组针对三桠苦种子发芽率极低的情况展开了系统研究。基于前期预实验,本课题组提出假说,“三桠苦种子可能存在休眠现象”。本研究首先通过生物学特性研究全面掌握三桠苦种子的生物学特性,推测三桠苦种子具有休眠特性,为三桠苦种子的休眠解除方法研究提供一个方向;其次,通过尝试多种处理方法,筛选得到简单实用的破眠方法,并为三桠苦种子休眠解除机理研究提供理想的测序材料;再次,在大棚内进行发芽试验,考察在实验室中摸索出的种子处理方法对实际生产的适用性;然后,通过尝试在多种条件下进行发芽试验,筛选出三桠苦种子的适宜采收期和萌发条件;最后,建立了三桠苦种子的全长转录组作为参考序列,并对休眠解除前后的种子进行比较组学研究,以阐明三桠苦种子的休眠解除机理。主要研究结果如下:1.三桠苦种子的生物学特性在接近成熟期间,三桠苦果实经历了果皮开裂和干枯的过程。在生长过程中,三桠苦种子从白色变为黄色,再变为红色,最后变为黑色。成熟的三桠苦种子的质量较小,千粒重为7.53±0.07 g;其所含水分较少,含水量为11.81 ± 0.14%,便于种子贮藏;其体积较小,长为 2.89±0.10 mm,宽为 2.23±0.14 mm,厚为 1.84±0.10 mm。成熟的三桠苦种子呈椭球形,由种皮、胚乳和双子叶的胚组成,种皮表面覆盖了一层黑色油亮的蜡质。按照胚乳的有无进行植物学分类,三桠苦种子属于双子叶植物有胚乳种子类别。本研究还观察并记录了三桠苦种子的整个发芽过程。最后,将三桠苦与同科具有休眠的其他物种的种子的生物学特性进行了比较,推测种皮可能是三桠苦种子休眠的一种重要因素。2.三桠苦种子具有复合休眠考察了多种种皮处理方法对三桠苦种子发芽率的影响。三桠苦种子经过浓硫酸处理(在浓硫酸中浸泡2、4或6分钟)、氢氧化钠溶液处理(在30%氢氧化钠溶液中浸泡10、20或30分钟)或搓洗处理后,发芽率均显著提高,说明三桠苦种子具有种皮引起的物理休眠。在所有种皮处理组中,搓洗处理组的发芽率最高(42.67±4.62%),与其它处理组的发芽率相比,均具有统计学差异。因此,搓洗处理被优选为最佳的种皮前处理方法。经过种皮前处理后发芽率显著提高,但仍低于50%,且发芽周期较长(2个月)。因此,本课题组推测三桠苦种子可能还存在生理休眠。采用三种常用的生理休眠解除方法(低温层积、暖温层积和赤霉素溶液浸种处理)进行试验。结果表明,经过种皮前处理的三桠苦种子低温(4℃)层积15天和30天,发芽率没有进一步显著提高。经过种皮前处理的三桠苦种子暖温(30℃)层积5天,发芽率没有进一步显著提高;而暖温(30℃)层积10和15天,发芽率进一步显著提高,且暖温层积15天的效果最好(发芽率为82.00±3.46%)。经过种皮前处理的三桠苦种子在100、200、300和400 mg·L-1的赤霉素溶液中浸泡24小时后,发芽率都进一步显著提高,且300 mg·L-1的赤霉素溶液处理效果最好(发芽率为77.33±5.03%)。这说明三桠苦种子同时具有种胚引起的生理休眠。因此,三桠苦种子具有复合休眠,搓洗处理加暖温层积15天(或在300 mg·L-1的赤霉素溶液中浸泡24小时)可以解除三桠苦种子的复合休眠。为了考察实验室中筛选出的种子处理方法对三桠苦实际生产的适用性,还进行了大棚发芽试验。在大棚条件下,种皮处理组的发芽率显著高于种皮未处理组;种皮处理联合100 mg·L-1或300 mg·L-1的赤霉素处理组的发芽率都显著高于单纯种皮处理组。种皮处理联合暖温层积5天组的发芽率与单纯种皮处理组的发芽率无统计学差异;种皮处理联合暖温层积15天组的发芽率显著高于单纯种皮处理组的发芽率。大棚发芽试验结果的总体趋势与实验室结果基本一致,表明了在实验室中摸索出的三桠苦种子处理方法对于实际生产具有良好的适用性。3.三桠苦种子的适宜采收期和萌发条件考察了不同采收期、不同发芽床、光照有无和不同温度对三桠苦种子发芽率的影响。果皮在树上大规模自然开裂时采集的三桠苦种子的发芽率更高;不同发芽床上培养的三桠苦种子,以及不同光照条件下培养的三桠苦种子的发芽率无统计学差异,说明发芽床和光照对三桠苦种子发芽率无影响。在30℃(12 h)/20℃(12 h)变温条件下培养的三桠苦种子的发芽率显著高于20℃、25℃和30℃恒温下培养的三桠苦种子的发芽率,说明不同温度对三桠苦种子发芽率具有显著影响,且30℃(12 h)/20℃(12 h)的变温条件更有利于三桠苦种子的萌发。4.暖温层积解除三桠苦种子休眠的机理由于三桠苦没有参考基因组,在研究三桠苦种子的休眠解除机理之前,需要建立一个可用的参考序列。本研究采用三代和二代转录组测序技术,获得了 98892个isoforms和93481个unigenes作为参考序列。通过比较转录组学研究,共鉴定到89216个倍数变化大于2的差异表达基因。其中,54686个差异表达基因显著上调,34530个差异表达基因显著下调。根据这些差异表达基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果,发现15天暖温(30℃)层积引起的三桠苦种子的生理休眠解除主要与植物激素信号传导通路中脱落酸受体、蛋白磷酸酶2C、赤霉素受体和DELLA蛋白等差异基因的显著变化,代谢通路中腺苷激酶、甘氨酸羟甲基转移酶、腺苷甲硫氨酸合成酶和二磷酸核苷激酶等差异表达基因的显著变化,翻译活动中翻译起始因子和热休克蛋白等差异表达基因的显著变化和氨基酸的生物合成中β-天冬氨酰-半醛脱氢酶、异丙基苹果酸合酶、酮醇酸还原异构酶和磷酸甘油酸脱氢酶等差异表达基因的显著变化相关。