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目的1.建立血液和尿液中海洛因主要代谢物M3G、吗啡和O6的固相萃取-液相色谱-串级质谱(SPE-LC-MS/MS)方法；2.通过动物实验完成空白添加血液和海洛因中毒血液中海洛因主要代谢物的保存稳定性研究；3.通过人体实验完成健康人尿液空白添加和海洛因吸食者尿液中海洛因主要代谢物的保存稳定性研究。方法1.海洛因主要代谢物固相萃取方法的研究对检材预处理后,采用BAKERBONDTM spe Octadecyl (C18)3cc500mg固相萃取柱进行提取,分析了不同pH值缓冲液条件、不同洗涤剂以及不同洗脱溶剂对海洛因主要代谢物固相萃取回收率的影响,完成固相萃取方法的优化。2.海洛因主要代谢物LC-MS/MS检测方法条件优化的研究对液相流动相、液相色谱柱、采集时间等进行LC-MS/MS检测方法条件优化；采用保留时间(Rt)、多反应检测(MRM)及内标法来对血液和尿液中海洛因主要代谢物进行定性定量分析。3.血液尿液中海洛因主要代谢物(M3G、吗啡、O6)稳定性研究取新鲜兔子空白血液和空白健康人体尿液作为检材,分别复制为均含M3G、吗啡和O6浓度均为200ng/mL的血液和尿液样本,通过对检材提取净化处理后,检测其在9个不同时间点、3个不同保存温度(20度、4度、-20度)下M3G、吗啡和O6的含量,研究其保存稳定性规律。①毒性动物实验毒性动物模型建立：选取3只体重相当的雄性兔子(日本纯种大耳兔),禁食24小时后,耳缘静脉注射海洛因的生理盐水5mg/kg两小时后,颈动脉插管,负压真空管采血。②人体实验检材来源于日常办案中所获确定为只吸食海洛因者的不同人的尿液4份。③将所获3份血液和4份尿液分别复制为0.4mL血液和0.9mL尿液若干份,放置并监测9个不同时间点、3个不同保存温度(20度、4度、-20度)下M3G、吗啡和O6的含量,研究其保存稳定性规律。验证实验取空白兔子血液和空白健康人体尿液各一份,一份未知浓度的已经部分分解为吗啡的O6标准溶液。将血液和尿液分别复制为合适浓度的血液和尿液样品若干份后,分别检测其存放在20度、4度、-20度条件下,0-14天(0、1、3、7、14)的吗啡和O6的含量。结果1.测得尿液中M3G、吗啡、O6-单乙酰吗啡的最低检测限(LOD)分别为1.24pg、6.71pg、0.47pg;血液中M3G、吗啡、O6-单乙酰吗啡的最低检测限分别为1.50pg、8.21pg、0.52pg。2.本文所建立的固相萃取方法,适用于血液、尿液检材,对两者有很好的净化富集作用；本文所建立的LC-MS/MS法,目标物质峰形良好,重复性好、检测时间为8.5min。3.血液尿液中海洛因主要代谢物(M3G、吗啡、O6)稳定性结果空白添加血液组O6：20度下,第14天O6组分百分比由初始的34.37%变为0.97%,4度下变为1.10%,-20度下变为14.26%。O6含量分别平均下降了97.51%、96.78%和49.73%。Morphine:第180天,4度和-20度下,吗啡组分百分比分别由初始的38.02%变为56.73%和66.49%。 M3G：第14天,20度、4度、-20度下,M3G组分百分比分别由初始的27.61%升高至41.04%、40.29%、33.88%。毒性动物血液组O6：第14天,B、C组,20度、4度、-20度条件下,O6组分百分比由初始的5.90%和1.66%,分别变化为0.06%、0.14%、1.66%和0.10%、0.19%、0.22%。Morphine:第14天,A、B、C组,20度、4度和-20度的条件下,吗啡组分百分比分别由初始的8.64%、6.07%、38.02%,分别变化为2.10%、4.19%、5.36%和0.63%、1.52%、3.34%及0.88%、2.62%、4.68%,Morphine含量平均分别下降了84.28%、63.10%和38.85%。 M3G：第14天,A、B、C组,20度、4度和-20度的条件下,M3G组分百分比分别由初始的89.18%、88.02%、91.29%,分别变化为97.52%、95.56%、94.42%和99.31%、98.34%、95.00%及99.01%、97.20%、95.10%。空白添加尿液组O6：第28天,20度下,O6组分百分比由初始的36.81%变为0.08%,4度下变为10.39%,-20度下变为28.29%,O6含量分别下降了99.78%、71.77%和23.15%。Morphine:第28天,20度、4度和-20度的条件下,吗啡组分百分比分别由初始的42.62%变为64.21%、56.26%和41.19%,吗啡含量分别上升了45.96%、32.00%和3.36%。M3G：第180天,4度和-20度下,M3G组分百分比由初始的20.57%变化为24.22%和20.33%。吸食海洛因者尿液组O6：A、B、D组,第28天,O6组分百分比由初始的0.04%、0.989%和2.74%均变为0。Morphine:第180天,A、B、C、D、E组,4度和-20度,吗啡组分百分比分别由初始的8.32%、7.22%、5.57%、5.79%和11.07%,分别变化为15.65%、12.41%；13.59%、14.22%；13.04%、12.41%；20.99%、16.37%和21.88、19.88%。M3G：第7天,20度、4度和-20度下,M3G组分百分比分别由初始的91.64%、91.79%、94.41%、91.47%和87.67%,分别变化为90.95%、94.05%、94.76%；91.29%、91.72%、91.81%；94.26%、94.24%、93.94%；93.81%、92.16%、92.73%和86.90%、86.14%、87.53%。验证实验组①空白添加血液组：第14天,室温下,吗啡组分百分比由初始的11%变化为100%,O6组分百分比由初始的89%变为0；-20度下,吗啡组分百分比变至29%,O6组分百分比变至71%。②空白添加尿液组：第14天,室温下,吗啡组分百分比由初始的1%变化为22%,O6组分百分比由初始的99%变为78%；-20度下,吗啡、O6组分百分比均没有明显变化。结论1.①采用Atalantis(?) HILIC Silica液相柱(2.1mm×150mm×3um),前接phenomenex保护柱(DIKMA公司,美国),出峰效果比C18柱好,因此采用前者色谱柱；液相流动相中均加入0.1%甲酸,可保证目标物峰形的对称性；在目标物出峰最佳状态下,采集时间最短可缩小至8.5分钟。LC-MS/MS条件优化后建立的方法,检测结果准确、灵敏、重现性好,能达到定性定量分析的要求。②本实验采用C18柱、MCX和CSGAU柱分别做为固相萃取小柱,平行操作,发现C18柱绝对回收率最高,重现性好。因此本文采用C18柱为固相萃取小柱对检材进行提取净化。③本文所建立的SPE-LC-MS/MS法,提取回收率、线性范围、检测灵敏度均达到血液和尿液中M3G、吗啡和O6的检验要求,可应用于甄别是否吸食海洛因或海洛因中毒(死)案件的法医学检验、法医毒物动力学和稳定性研究。2.血液尿液中海洛因主要代谢物稳定性规律血液样品O6含量下降；吗啡含量升高；M3G含量稳定、略升高。尿液样品O6含量下降；吗啡含量升高；M3G含量相对稳定。验证实验组空白添加血液组：无论室温和-20度下,吗啡含量均升高,O6含量均降低,且吗啡升高的量与O6降低的量一致；-20度下,O6降低幅度、吗啡升高幅度均小,较为稳定。空白添加尿液：同空白添加血液组。综上所述,06含量降低是因为其分解为吗啡,且此过程不可逆。