柚果,中药名,为芸香科植物柚（Citrus grandis（L.）Osbeck）及其变种的干燥未成熟果实。气芳香,味苦,微辛。柚果营养丰富,富含多种植物活性成分,如香精油、柚皮苷、果胶、柠檬苦素类似物等物质,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性,具有很高的保健及药用价值。目前,柚果深加工开发利用度低,柚皮苷传统萃取工艺存在环境污染等弊端,因此采用新型萃取技术应用于柚果深加工具有深远的意义。目前植物多糖的免疫活性有许多研究报道,但果胶的活性主要集中于其凝胶特性方面,免疫调节活性的研究较少。因此本课题以柚果为研究对象,采用连续相变萃取技术连续萃取柚果中香精油、柚皮苷成分,并对柚果果胶分级纯化得到的HPP-1组分进行结构鉴定,采用巨噬细胞模型对其体外免疫活性进行评价。主要研究结果如下:1、柚果基本成分分析。4月份的柚果中柚皮苷含量为干重34.53%,显著高于5月份的17.67%。果胶含量没有显著性差异,分别为10.14%和15.60%,因此选用4月份柚果为研究对象。柚果基本成分柚皮苷含量占干重34.53%,果胶含量为10.17%,香精油含量占5.03%,水不溶膳食纤维等其他成分占50.31%。2、采用连续相变萃取技术提取柚果中的香精油成分,香精油得率为1.12%。通过GC-MS分析柚果香精油的组成成分,共鉴定物质43种,D-柠檬烯含量检出最高为10.24%,其次是蛇床子素为8.69%,以及2,4-二叔丁基苯酚7.29%,反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇6.44%和樟脑6.41%。3、连续相变萃取柚果中柚皮苷。提取香精油后的脱酯柚果,通过考察连续相变萃取技术的萃取温度、萃取时间和原料颗粒度三个单因素对柚皮苷提取率的影响,通过响应面实验优化,得到最佳提取工艺为萃取温度75℃,萃取时间4 h,原料颗粒度为40目,该条件下柚皮苷提取率为99.47%,提取液中柚皮苷的干物质纯度为61.21%。表明连续相变萃取柚果中柚皮苷效果优异,具有绿色、高效的的特点,避免传统提取工艺中环境污染的弊端。4、活性果胶组分HPP-1分离纯化与结构解析。萃取柚皮苷后的柚果渣经过提取、浓缩、脱盐、醇沉和冷冻干燥后,得到柚果粗提果胶,得率为20.23%。粗果胶中总糖含量71.17%,半乳糖醛酸含量59.90%,蛋白含量1.93%,灰分4.33%,酯化度为44.65%。通过纤维素DEAE-52阴离子交换柱层析和葡聚糖凝胶G-200柱层析纯化得均一组分HPP-1。化学结构表明,果胶纯化组分HPP-1紫外光谱下无蛋白质特征吸收峰;平均分子量为5.9×104 Da;中性单糖组成主要由鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖和半乳糖组成,其摩尔比为1.00:11.12:2.26:0.56:6.40;傅里叶红外光谱、高碘酸氧化和Smith降解以及核磁共振13C NMR和1H NMR的结果表明HPP-1主要糖基为1,4-D-Gal A、1,6-β-D-Gal、1,6-β-D-Man、1,3-α-L-Ara和1,2-α-L-Rha。HPP-1的结构含有RG I与RG II的区域,是果胶型多糖。5、选用小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫调节模型对柚果果胶HPP-1组分的活性评价。结果表明,在浓度10-1000μg/m L范围内对巨噬细胞均无毒性,并且促进巨噬细胞的增殖和增强巨噬细胞吞噬作用。而且能够显著刺激巨噬细胞RAW 264.7分泌NO、TNF-α及IL-6。同时RT-PCR结果显示,HPP-1能够显著提高巨噬细胞的i NOS、TNF-α和IL-6的m RNA的表达量,并且呈明显的剂量效应。