第一部分人α防御素5改造的纳米抗生素的构建及表征研究目的:人α防御素5(humanα-defensin5,HD5)是人小肠潘氏细胞分泌产生的一种阳离子抗菌肽,由32个氨基酸组成。对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种病原菌均有杀灭作用。但是其杀菌作用容易受到氯化钠等多种因素的干扰,且作为多肽类物质的生物稳定性差,容易被酶降解。基于纳米科技进行药物改造已经成为最近研究的热点。因此,本部分研究致力于将HD5纳米化改造,研究改造后的纳米颗粒大小、电位及稳定性等。研究方法:设计HD5改造体的分子结构,具体在HD5的氮端或者碳端增加疏水性的肉豆蔻酸,为了避免肉豆蔻酸对HD5的分子造成影响,增加甘氨酸作为连接HD5和肉豆蔻酸的中间体。此外,由于HD5的碳端不存在游离的氨基,在碳端改造时,又在HD5的碳端连接一个额外的赖氨酸,在该赖氨酸的ε氨基上连接肉豆蔻酸。氮端肉豆蔻酰化的改造体命名为myr-HD5,碳端肉豆蔻酰化的改造体命名为HD5-myr。通过固相合成的方法合成。通过高效液相色谱分离并验证纯度,通过质谱分析验证分子的成功合成。将多肽溶解在水中,应用动态光散射检测纳米颗粒的直径及 Zeta 电位。应用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)进一步验证纳米颗粒的存在以及直径。检测改造体及HD5在去离子水、DMEM培养基中以及小鼠血清中的稳定性。研究结果:HD5的纯度为99.6%,分子量为3582.4 Da,与理论分子量3582.1 Da吻合。myr-HD5的纯度为97%,分子量为3849.6Da,与理论分子量3849.5 Da吻合。HD5-myr的纯度为98.5%,分子量为3976.7Da,与理论分子量3976.7Da吻合。通过动态光散射的方法检测myr-HD5水溶液中的颗粒的流体力学直径为80.2 ± 2.2 nm,HD5-myr 为 56±8.4nm。颗粒的多分散指数(polydispersityindex,PDI)较小。myr-HD5的Zeta电位为44.9±3.8mV,HD5-myr为21.8±4.3mV。证明这两种纳米颗粒在溶液中稳定存在。TEM观察进一步确定HD5-myr及myr-HD5在水中形成纳米颗粒,而HD5则不能形成纳米颗粒。在水溶液、生理盐溶液及DMEM培养基中,HD5和HD5-myr分子均可稳定存在至少48 h,表现为高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测其目的峰的高度及峰面积在48h内保持不变。在小鼠血清中,HD5容易被降解,其稳定存在时间少于24h。而HD5-myr则稳定存在至少48 h。研究结论:在HD5分子上连接肉豆蔻酸可以有效形成纳米颗粒,形成纳米颗粒可以有效增强血清中的稳定性。第二部分人α防御素5改造的纳米抗生素的体外杀菌效果及体内外毒性研究研究目的:鉴于HD5成功改造成为一种纳米颗粒,我们进一步探讨其对临床常见的致病菌的杀菌效果及体内外的毒性。研究方法:选取临床上病人最易感的几种细菌作为受试菌株,包括:大肠杆菌(E.coli),金黄色葡萄球菌(S.aures),耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA),肺炎克雷伯杆菌(K.pneuumoniae),绿脓杆菌(P.aeruginosa)和鲍曼不动杆菌(A.baumannii)。采用虚拟克隆计数的方法,对比原始HD5和改造后的纳米抗生素myr-HD5及HD5-myr的杀菌效果的差异。挑取单菌落的受试菌种,培养4-6小时,使用磷酸盐缓冲液(pH=7.4)洗涤,并分别将它们与不同浓度的抗菌肽进行孵育,2小时后加入培养基,在酶标仪上动态测量各组OD值的变化情况,依据OD值到达某个临界值的时间不同,计算杀菌效果。此外,检测它们在氯化钠、血清中的杀菌效果。检测毒性时,选小鼠红细胞和巨噬细胞系作为受试细胞,使用两性霉素B脂质体作为对照,检测纳米抗生素对红细胞的溶血毒性。使用MTT法检测纳米抗生素对于小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞活性的影响。使用庆大霉素保护实验检测对巨噬细胞杀菌功能的影响。此外,给予小鼠腹腔注射纳米抗生素,观察小鼠体重的动态变化,检测纳米抗生素的体内毒性。研究结果:改造的纳米抗生素HD5-myr对于所有的受试菌种都有较强的杀灭效果,比如,其可使E.coli的细菌数量下降7个数量级(细菌数量下降至对照组的10的7次方分之一),使S.aurezus的细菌数量下降4数量级,使MRSA和A.baumannii的细菌数量下降5个数量级,使P.aeruginosa的细菌下降6个数量级,使K.pneumoniae的细菌数量下降9个数量级。而HD5的杀菌效果则有限。差异均具有统计学意义。改造的my-HD5纳米抗生素可以有效杀灭格兰氏染色阳性菌SS.aureus和MRS A,但是对于格兰氏染色阴性菌K.pneumoniae,P.aeruginosa,A.baumanni和E.coli的杀菌效果不明显,且弱于HD5。由于NaCl会显著降低HD5的杀菌效果,因此进一步检测了不同浓度的NaCl对它们的杀菌效果的影响。在不同浓度的NaCl溶液中,HD5及HD5-myr的杀菌效果均下降。其中,HD5基本无杀菌效果,而HD5-myr依然有较强的杀灭E.coli的效果。在150mM的NaCl溶液中,25 μg/ml的HD5-myr仍可以使E coli的细菌数量下降3个数量级。此外,检测它们在血清当中的杀菌效果,在50%的小鼠血清中,50μg/ml的HD5-myr仍保留较好的杀菌效果。其可使E.coli细菌数量下降5个数量级,可以使MRSA的细菌数量下降3个数量级。毒性实验检测显示HD5,myr-HD5以及HD5-myr的溶血性均较低。在400μg/ml的浓度下,HD5、myr-HD5及HD5-myr组的溶血率均低于5%,而同浓度两性霉素B脂质体组则高达30%以上。通过MTT实验检测,HD5-myr对于小鼠巨噬细胞系的毒性较低,在100μg/ml时,RAW264.7细胞的活性大于90%,而两性霉素B脂质体组的细胞存活率仅为40%。体内实验证实,小鼠腹腔注射60μg的myr-HD5之后,小鼠的体重无明显变化。证实HD5-myr较为安全。研究结论:在HD5的碳端改造获得的纳米抗生素显著增加了杀菌效果。对HD5的氮端改造的纳米抗生素增强了杀菌格兰氏阳性细菌的能力,但是减弱了杀灭格兰氏阴性细菌的能力。改造的纳米抗生素的毒性较低。第三部分人α防御素5改造的纳米抗生素HD5-myr对脓毒症小鼠和皮肤感染小鼠的治疗作用研究研究目的:由于改造的纳米抗生素HD5-myr在体外实验中良好的杀菌效果及具有良好的安全性。本部分构建小鼠腹腔感染E.coli的脓毒症模型和皮肤感染MRSA的模型,验证HD5改造的纳米抗生素HD5-myr的体内效果。研究方法:小鼠腹腔注射致死剂量的E.coli,构建小鼠腹腔感染E.coli的脓毒症模型,然后分别给予HD5(10μg/只)、HD5-myr(100μg/只和20μg/只)或者给予生理盐水(对照)进行治疗。观察四组小鼠生存率。给予小鼠致死剂量的E.coli,构建小鼠腹腔感染E.coli的脓毒症模型,分别给予小鼠HD5(20μg/只)或者HD5-myr(20μg/只)或对照,7小时后取材,分别检测肝、肾、脾、肺、血液及腹腔灌洗液中的细菌负荷。此外,对肝脏、肾脏和肺脏进行HE染色及病理评分,以评估对腹腔感染小鼠的治疗效果。构建小鼠皮肤感染MRSA模型,分别使用12μg的HD5或者HD5-myr进行治疗。与对照组对比,治疗24小时后,检测皮损处皮肤表面以及皮肤内部的细菌负荷的差异,观察其治疗效果。研究结果:小鼠腹腔注射E.coli的最低致死剂量为7X 106 CFU,给予小鼠腹腔注射该剂量的细菌,100%的小鼠在24小时内死亡。10 μg的HD5治疗,可以使小鼠的存活率提高到30%,但生存曲线的差异并没与统计学意义。10μg的HD5-myr的治疗,可以使小鼠生存率提高至70%,差异具有统计学意义(**,p<0.01),进一步增加HD5-myr的治疗剂量至20μg,其可进一步提高生存率至90%(***,p<0.001)。证明HD5-myr对小鼠腹腔感染E.coli的脓毒症模型具有明显的治疗效果。进一步使用小鼠腹腔感染E.coli的脓毒症模型,分别使用10μg的HD5或者HD5-myr进行治疗,7小时后解剖探查,观察小鼠的肝脏、肺脏,可以看到HD5-myr治疗组的脏器形态接近于正常小鼠,肝脏呈现红色,肺脏灰白色,而HD5治疗组的脏器则类似于未治疗组,其肝脏呈现暗红色,肺脏呈现红色,有较多的斑片状的淤血及出血。使用小鼠腹腔注射E.coli模型,分别给予20ug的HD5或HD5-myr治疗,7小时后处死,并取肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、血液和腹腔灌洗液,可见HD5-myr及HD5治疗后均可以显著降低各个脏器的细菌负荷及脏器损伤,病理学评分均具有显著的统计学差异。HD5-myr治疗组的效果显著优于HD5治疗组。在小鼠皮肤感染MRSA模型上,12μg的HD5-myr与对照组相比可以显著降低皮肤表面及皮肤内部的细菌负荷(**,p<0.01),而同剂量的HD5治疗后,其皮肤表面与皮肤内部的细菌负荷与对照组相比则无统计学差异。研究结论:HD5-myr通过减轻细菌负荷及脏器损伤显著改善了腹腔注射E.coli的脓毒症小鼠的生存率;HD5-myr可以有效降低小鼠皮肤感染的细菌负荷。第四部分HD5-myr纳米抗生素的杀菌机制研究研究目的:HD5-myr在体内外均有良好的杀菌效果。我们进一步研究其杀菌机制。研究方法:设计并合成构建TAMRA荧光标记的HD5和HD5-myr,分别命名为TAMRA-HD5和TAMRA-HD5-myr,分别与表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的E.coli共同孵育10分钟,在共聚焦显微镜下观察它们与细菌的结合。将表达EGFP的E.coli静脉注射到小鼠体内后,静脉注射TAMRA-HD5-myr,通过在体双光子显微镜观察肽和细菌的结合情况。将HD5、myr-HD5及HD5-myr分别和E.coli或MRSA孵育2h,后通过扫描电子显微镜(SEM)观察细菌表面形态的变化。以研究其杀菌机制。研究结果:细菌和TAMRA-HD5-myr及TAMRA-HD5共同孵育10分钟之后,TAMRA-HD5-myr与细菌有更强的结合。证明HD5-myr具有良好的结合细菌的能力。静脉注射表达EGFP的E.coli之后静脉注射TAMRA-HD5-myr,可以看到两者的共定位,证明在体内HD5-myr可以有效与细菌结合。通过SEM观察HD5、myr-HD5及HD5-myr处理过的MRSA和E.coli,可以看到细菌表面形态的变化程度与肽对该种细菌的杀灭能力呈正相关。HD5处理过,,E.coli的表面有许多的小泡形成,遍布细菌的表面。myr-HD5处理过则表面的形态变化不明显。而HD5-myr处理之后,E.coli的表面形成了许多的孔洞,这些孔洞较为均一,边缘不规则。HD5使MRSA表面变得粗糙,myr-HD5和HD5-myr也均使MRSA的表面更加粗糙,且粗糙的程度更重。研究结论:HD5-myr可以有效与细菌结合;与原始HD5通过破坏外膜杀灭E.coli的机制不同,HD5-myr通过在细菌表面打洞,破坏了全层的细胞膜及细胞壁,改变了杀菌机制。