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目的通过体外实验及半体内人源大肠癌类器官（Patient-derived colorectal cancer organoid,CRC-PDO）模型,基于C-Kit/Slug信号轴探讨蟾毒灵（Bufalin）抑制大肠癌细胞干性及上皮-间质转化（Epithelial–mesenchymal transition,EMT）的作用机制。方法1.蟾毒灵对大肠癌细胞生长和增殖的影响:使用不同浓度的蟾毒灵干预大肠癌细胞系（HCT116、DLD1、SW480）24或48 h,采用Calcein-AM（标记活细胞）和PI（标记死细胞）荧光标记检测蟾毒灵对大肠癌细胞生长的影响,MTT和集落形成实验检测蟾毒灵对大肠癌细胞增殖的影响。2.蟾毒灵对大肠癌细胞干性和EMT的影响:使用不同浓度的蟾毒灵干预大肠癌细胞系,（1）基质胶成球实验检测蟾灵对大肠癌干性的影响;（2）ALDEFLUOR实验检测蟾毒灵对大肠癌细胞乙醛脱氢酶（Aldehyde Dehydrogenase,ALDH）活性的影响;（3）检测蟾毒灵对大肠癌细胞迁移和侵袭的作用:划痕实验检测蟾毒灵对大肠癌细胞迁移能力的影响,Transwell迁移和侵袭实验检测蟾毒灵对大肠癌迁移和侵袭能力的影响,免疫荧光检测β-catenin的表达定位、Western blot检测细胞核和细胞质中β-catenin的表达量;（4）采用Western blot检测EMT标志物N-cadherin、ZEB1和Slug的表达,检测干细胞标志物CD44、ALDH1A1、C-Myc、SOX2、KLF4、CD133、Nanog和干细胞因子受体C-Kit的表达,以评估蟾毒灵对大肠癌干性和EMT的影响。3.蟾毒灵对大肠癌细胞株C-Kit/Slug信号轴的影响:使用Gene Mania网络分析以上实验中被显著调控蛋白C-Kit和Slug的作用关系,发现C-Kit和Slug具有通路直接相关性且与EMT关系密切。（1）选择C-Kit表达较低的SW480细胞株,采用质粒转染的方法构建C-Kit过表达SW480细胞,Western blot和RT-q PCR检测C-Kit过表达大肠癌细胞SW480中C-Kit和Slug的表达,基质胶成球实验检测C-Kit过表达对大肠癌干性的影响及蟾毒灵的干预作用。（2）选择Slug表达较低的DLD1细胞株构建Slug过表达稳转株,Western blot检测Slug过表达大肠癌细胞DLD1中C-Kit和Slug的表达,基质胶成球实验检测Slug过表达对大肠癌干性的影响及蟾毒灵的干预作用。4.蟾毒灵对CRC-PDOs中C-Kit/Slug信号轴的影响:（1）CRC-PDOs的建立及蟾毒灵对CRC-PDOs生长的影响:在患者知情同意的前提下,从福州市中医院内镜中心获得患者结直肠内镜检查活检组织。从确诊的腺瘤/腺癌病例分离上皮隐窝,在减少生长因子的基质胶和含有干细胞生长因子的培养基中培养,直到形成成熟的CRC-PDOs（7～21d）,传代并种板进行实验。蟾毒灵处理期间,隔天拍照记录类器官形态和数量的变化。实验结束后,用Calcein-AM标记活细胞,并拍摄荧光照片,评估蟾毒灵对CRC-PDOs生长的影响。（2）用Western blot检测蟾毒灵对CRC-PDOs中C-Kit、Slug和干细胞标志物CD133、C-Myc和EMT标志物E-cadherin的影响。结果1.蟾毒灵抑制大肠癌细胞生长和增殖能力:与DMSO组相比,蟾毒灵显著抑制大肠癌细胞HCT116(IC50:1.661 n M)、DLD1(IC50:4.279 n M)和SW480的增殖(IC50:30.03 n M),且具有浓度依赖性。Calcein-AM和PI染色显示蟾毒灵对大肠癌细胞的生长抑制作用具有浓度依赖性（P＜0.0001）。蟾毒灵以浓度依赖方式抑制三株大肠癌细胞的集落形成,4 n M浓度显著抑制HCT116的集落形成（P=0.007）,8 n M和16 n M浓度可显著抑制DLD1和SW480的集落生成（P＜0.05）。2.蟾毒灵抑制大肠癌细胞干性和EMT:基质胶成球实验表明蟾毒灵（8 n M）显著抑制了大肠癌细胞的成球能力即干性特征（与DMSO组相比,P＜0.05）。蟾毒灵能够降低大肠癌ALDH活性细胞的数量。与DMSO组相比,蟾毒灵显著抑制大肠癌细胞HCT116、DLD1和SW480划痕后的愈合,8 n M的蟾毒灵在48 h时对DLD1和HCT116细胞具有显著抑制迁移的作用（P＜0.0001）,在72 h时对SW480具有显著抑制迁移的作用（P＜0.0001）。与DMSO组相比,蟾毒灵（40 n M）在48 h显著抑制了三种大肠癌细胞系的Transwell迁移和侵袭能力（HCT116:P＜0.0001、DLD1:P=0.0002、SW480:P=0.0072）。免疫荧光和Western blot结果显示40 n M的蟾毒灵显著降低HCT15细胞核及HCT116、DLD1细胞质中β-catenin的表达,同时显著下调SW480细胞核和细胞质中β-catenin的表达。Western blot结果表明蟾毒灵能够显著下调HCT116、DLD1和SW480的EMT转录因子SNAI2（Slug）和间质细胞标志物N-cadherin的表达,并且显著下调HCT116和DLD1中EMT转录因子ZEB1的表达（均P＜0.05）。在分子水平上,通过Western blot实验发现蟾毒灵显著抑制上述三种大肠癌细胞系干细胞标志物CD44、ALDH1、C-Myc、SOX2、KLF4和C-Kit的表达,显著下调HCT116和DLD1中CD133的表达,显著下调DLD1和SW480中NANOG的表达（均P＜0.05）。3.蟾毒灵通过C-Kit/Slug信号轴抑制大肠癌细胞的干性:前期Gene Mania网络分析蟾毒灵可能通过C-Kit/Slug信号轴发挥作用,经上述实验证实,蟾毒灵显著下调大肠癌细胞中C-Kit和Slug的表达。与对照组相比,C-Kit过表达促进了大肠癌细胞SW480的干性,表现为基质胶球体数量显著增加（P=0.0306）,8 n M的蟾毒灵未表现出明显抑制成球作用,Western blot和RT-q PCR结果表明C-Kit过表达能显著上调Slug的表达水平;Slug过表达能够促进大肠癌细胞DLD1的干性,表现为基质胶球体数量显著增加（P=0.006）,8 n M的蟾毒灵未表现出明显抑制成球作用,Western blot结果表明Slug过表达能显著上调C-Kit的表达。4.蟾毒灵通过C-Kit/Slug信号轴抑制CRC-PDOs的生长:蟾毒灵显著抑制3个CRC-PDOs模型的生长和存活,表现在显著降低类器官数量（0519:P=0.0042,0528:P=0.0203,0714:P=0.0054）和0519、0528的体积（P＜0.05）,样本1208和1101对蟾毒灵并不敏感,表现出较弱或无抑制作用。并且,在这些具有较强蟾毒灵应答的CRC-PDOs中,形态变化也提示蟾毒灵的抗肿瘤活性,表现在CRC-PDOs结构断裂和特征性的凋亡空泡的形成,此外,Calcein-AM活细胞染色同样证实了活CRC-PDOs数量的减少。并且,蟾毒灵能够显著降低CRC-PDOs（0519,0528,0714）中C-Kit,Slug,CD133和C-Myc的表达,并上调EMT标志物E-cadherin的表达,而在具有较弱应答的CRC-PDO样本1208和1101中C-Kit和Slug轻微或无下调。结论本研究结果表明蟾毒灵体外以及半体内干预均能抑制大肠癌生长和增殖能力,蟾毒灵体外干预能够抑制大肠癌细胞基质胶成球能力、ALDH活性以及迁移和侵袭,这些抑制作用与C-Kit/Slug信号轴的改变有关,即蟾毒灵通过C-Kit/Slug信号轴显著调控了大肠癌的生长、干性和EMT特征。