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目的：鉴定一掌跖角化病家系的致病位点，分析其临床病理特征，探寻该家系的发病原因，研究家系中LOR基因c.323G＞C突变蛋白的亚细胞定位变化及对HaCaT细胞株凋亡、增值分化及细胞周期可能的影响。
方法：收集一掌跖角化病家系中相关成员的外周血、绘制系谱图并判断遗传方式。采用二代捕获测序检测目前已知与人类皮肤病相关的267个基因，对可疑变异位点用Sanger测序在家系中做验证；用生物信息学工具对LOR基因c.323G＞C变异进行突变致病性分析及氨基酸保守性分析；用免疫组化的方法分析此家系患者临床病理特征。构建pcDNA3.1/V5-His-wild-LOR,pcDNA3.1/V5-His-c.323G＞C-LOR和pcDNA3.1/V5-His-730insG-LOR三个表达载体并将其分别通过核转染的方式转入HaCaT细胞株，利用激光扫描共聚焦显微镜观察兜甲蛋白（loricrin）在细胞内的定位、用流式细胞计数检测突变后的兜甲蛋白对细胞凋亡及细胞周期的影响、通过荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time PCR，QPCR）检测突变后的兜甲蛋白对HaCaT细胞丝聚蛋白原N端结构域（profilaggrin N-terminal domain，PND）和caspase14蛋白转录水平的变化。
结果：先证者和他患病的父亲在LOR基因上均携带杂合错义突变c.323G＞C，该突变导致LOR蛋白保守位置108位的Gly被Ala取代，先证者表型正常的母亲则不携带该突变。生物信息学分析提示该突变具有潜在致病性；免疫组化结果显示此家系患者出现基底层细胞过度增殖，棘层、颗粒层、角质层增厚，皮肤过度角化，角质层中有部分细胞核的残留。突变后的兜甲蛋白大量聚集在细胞质中，细胞核中兜甲蛋白表达量较少，甚至不表达；I-TASSER结果显示：突变后兜甲蛋白结合的配体类型、酶的活性位点均发生了改变；Pymol构建兜甲蛋白二维结构显示：突变蛋白108号位点与相邻两个氨基酸残基之间的氢键均变长且由6个alpha螺旋变为8个alpha螺旋，螺旋位点不匹配。激光共聚焦显微镜观察显示：转染pcDNA3.1/V5-His-730insG-LOR质粒的HaCaT细胞株中，突变蛋白主要分布在细胞核内，而转染pcDNA3.1/V5-His-c.323G＞C-LOR质粒的HaCaT细胞株中，突变蛋白主要分布在细胞质内，而野生型loricrin蛋白在细胞核和细胞质中则均匀分布。LOR基因c.323G＞C突变兜甲蛋白对HaCaT细胞株的细胞周期和凋亡没有检测到明显改变。QPCR结果显示，过表达LOR基因c.323G＞C和730insG两种突变体蛋白均导致HaCaT细胞株内PND的转录水平下降，转染野生型LOR质粒的PND基因mRNA的相对量为1.490，转染c.323G＞C质粒细胞株内PND基因mRNA的相对量为0.91，转染730insG阳性对照质粒细胞株内PND基因mRNA的相对量为0.613(P值＜0.05)。过表达LOR野生型蛋白、c.323G＞C与730insG两种突变体蛋白后，HaCaT细胞株内caspase14基因mRNA的相对量为0.649，0.449与0.253(P值＜0.05)。
结论：该兜甲蛋白皮肤角化病（Loricrin Keratoderma,LK）家系中，LOR基因杂合c.323G＞C错义突变是其致病的病因，该突变导致延迟显性和进行性加重为主要特征的兜甲蛋白皮肤角化病是首次报道。c.323G＞C突变后的兜甲蛋白空间结构改变可能削弱了其入核能力，致其高度聚集于细胞质中，根据患者皮肤组织免疫组化的结果和HaCaT细胞株内实验结果推测c.323G＞C突变蛋白可能会干扰人角质形成细胞的分化进程而导致掌跖过度角化的发生。我们的研究丰富LOR基因的突变谱及loricrin keratoderma的遗传学特征并首次发现突变后的兜甲蛋白在细胞质中高度聚集与突变的兜甲蛋白在细胞核中高度聚集同样会导致LK病的发生。
方法：收集一掌跖角化病家系中相关成员的外周血、绘制系谱图并判断遗传方式。采用二代捕获测序检测目前已知与人类皮肤病相关的267个基因，对可疑变异位点用Sanger测序在家系中做验证；用生物信息学工具对LOR基因c.323G＞C变异进行突变致病性分析及氨基酸保守性分析；用免疫组化的方法分析此家系患者临床病理特征。构建pcDNA3.1/V5-His-wild-LOR,pcDNA3.1/V5-His-c.323G＞C-LOR和pcDNA3.1/V5-His-730insG-LOR三个表达载体并将其分别通过核转染的方式转入HaCaT细胞株，利用激光扫描共聚焦显微镜观察兜甲蛋白（loricrin）在细胞内的定位、用流式细胞计数检测突变后的兜甲蛋白对细胞凋亡及细胞周期的影响、通过荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time PCR，QPCR）检测突变后的兜甲蛋白对HaCaT细胞丝聚蛋白原N端结构域（profilaggrin N-terminal domain，PND）和caspase14蛋白转录水平的变化。
结果：先证者和他患病的父亲在LOR基因上均携带杂合错义突变c.323G＞C，该突变导致LOR蛋白保守位置108位的Gly被Ala取代，先证者表型正常的母亲则不携带该突变。生物信息学分析提示该突变具有潜在致病性；免疫组化结果显示此家系患者出现基底层细胞过度增殖，棘层、颗粒层、角质层增厚，皮肤过度角化，角质层中有部分细胞核的残留。突变后的兜甲蛋白大量聚集在细胞质中，细胞核中兜甲蛋白表达量较少，甚至不表达；I-TASSER结果显示：突变后兜甲蛋白结合的配体类型、酶的活性位点均发生了改变；Pymol构建兜甲蛋白二维结构显示：突变蛋白108号位点与相邻两个氨基酸残基之间的氢键均变长且由6个alpha螺旋变为8个alpha螺旋，螺旋位点不匹配。激光共聚焦显微镜观察显示：转染pcDNA3.1/V5-His-730insG-LOR质粒的HaCaT细胞株中，突变蛋白主要分布在细胞核内，而转染pcDNA3.1/V5-His-c.323G＞C-LOR质粒的HaCaT细胞株中，突变蛋白主要分布在细胞质内，而野生型loricrin蛋白在细胞核和细胞质中则均匀分布。LOR基因c.323G＞C突变兜甲蛋白对HaCaT细胞株的细胞周期和凋亡没有检测到明显改变。QPCR结果显示，过表达LOR基因c.323G＞C和730insG两种突变体蛋白均导致HaCaT细胞株内PND的转录水平下降，转染野生型LOR质粒的PND基因mRNA的相对量为1.490，转染c.323G＞C质粒细胞株内PND基因mRNA的相对量为0.91，转染730insG阳性对照质粒细胞株内PND基因mRNA的相对量为0.613(P值＜0.05)。过表达LOR野生型蛋白、c.323G＞C与730insG两种突变体蛋白后，HaCaT细胞株内caspase14基因mRNA的相对量为0.649，0.449与0.253(P值＜0.05)。
结论：该兜甲蛋白皮肤角化病（Loricrin Keratoderma,LK）家系中，LOR基因杂合c.323G＞C错义突变是其致病的病因，该突变导致延迟显性和进行性加重为主要特征的兜甲蛋白皮肤角化病是首次报道。c.323G＞C突变后的兜甲蛋白空间结构改变可能削弱了其入核能力，致其高度聚集于细胞质中，根据患者皮肤组织免疫组化的结果和HaCaT细胞株内实验结果推测c.323G＞C突变蛋白可能会干扰人角质形成细胞的分化进程而导致掌跖过度角化的发生。我们的研究丰富LOR基因的突变谱及loricrin keratoderma的遗传学特征并首次发现突变后的兜甲蛋白在细胞质中高度聚集与突变的兜甲蛋白在细胞核中高度聚集同样会导致LK病的发生。