神经病理性疼痛(Neuropathic Pain,NPP)发病机制的探索,新的药物作用靶点的发现以及新型有效防治药物的寻找,为目前重要的研究方向。从药用植物中寻找抗NPP活性成分并深入进行相关的关键科技问题探索研究是创制新型抗NPP药物的重要途径。钩吻素子(koumine)为国产钩吻生物碱单体中含量最高的一种有效成分,属于单萜吲哚生物碱,分子量为306.3。本课题组先期系列研究表明,钩吻素子具有高效低毒的抗NPP作用,脊髓是其发挥效应的重要作用部位,但其深入作用机制有待于探索。新近研究资料显示,神经病理性疼痛等病理性疼痛可致脊髓背角胶质细胞的活化,进而释放一系列的神经活性物质和致炎细胞因子,籍此在慢性疼痛痛敏的发生与维持中发挥重要作用。TSPO[translocator protein(18 k Da)],是一种包含169个氨基酸的疏水性18 k Da蛋白,主要定位于线粒体外膜,在神经组织主要分布于神经胶质细胞,可望成为治疗某些神经精神疾病包括NPP的治疗靶点。本课题组前期工作提示钩吻素子抗NPP效应可能与其与其调节脊髓神经胶质细胞以及TSPO有关。鉴此,本文拟探讨钩吻素子抗NPP效应与其调节脊髓背角神经胶质细胞活化的关系;分析钩吻素子抗NPP作用与脊髓TSPO表达与激活的关系;从与TSPO亲和力以及TSPO介导孕烯醇酮生成功能的层面,探索钩吻素子对TSPO的调节作用,以期阐释钩吻素子抗NPP作用的脊髓分子机制,初步分析其作用靶点。主要研究内容如下:1.钩吻素子的抗神经病理性疼痛效应与其调节脊髓背角胶质细胞活化的关系在大鼠坐骨神经慢性束缚损伤(chronic constriction injury,CCI)神经病理性疼痛模型上,应用荧光免疫组织化学技术检测小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的特异性标记物,观察神经病理性疼痛发生发展过程中脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞活化的动态变化。实验动物随机分为空白对照组(Naive)、假手术组(Sham)、CCI模型组,分别于术后第3天、第6天、第9天上午测痛后断头处死大鼠,取腰5-6段脊髓进行荧光免疫组化;同时观察持续给予钩吻素子后,大鼠疼痛行为、胶质细胞活化的动态变化,实验动物随机分为CCI+生理盐水组、CCI+钩吻素子组(7 mg/kg)、CCI+钩吻素子低剂量(0.28 mg/kg)组,CCI术后,CCI模型组大鼠皮下注射生理盐水,CCI大鼠给药组大鼠皮下注射对应药物,每天1次,连续7天,在第7天给药测痛后1小时处死各组大鼠,进行免疫组化实验。结果表明,脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞在外周神经损伤致神经病理性疼痛过程中均呈现动态活化,而且小胶质细胞活化早于星形胶质细胞。在这过程中,给予钩吻素子在发挥镇痛效应同时,可显著抑制脊髓背角星形胶质细胞的活化,而对小胶质细胞的活化未有显著影响,提示抑制脊髓星形胶质细胞的活化可能是钩吻素子抗神经病理性疼痛的作用机制之一。2.钩吻素子抗神经病理性疼痛作用与脊髓背角TSPO表达的关系首先,运用荧光免疫组织化学的方法观察在CCI模型上不同时程脊髓背角TSPO表达的变化。实验动物随机分为空白对照组(Naive)、假手术组(Sham)、CCI模型组,分别于术后第3天、第6天、第9天上午测痛后断头处死大鼠,取腰5-6段脊髓进行荧光免疫组化。同时,通过荧光免疫组化技术观察CCI大鼠钩吻素子治疗后脊髓背角TSPO的表达变化。实验动物随机分为CCI+生理盐水组、CCI+钩吻素子高剂量(7 mg/kg)组、CCI+钩吻素子低剂量(0.28 mg/kg)组,CCI术后,CCI模型组大鼠皮下注射生理盐水,CCI大鼠给药组大鼠皮下注射对应药物,每天1次,连续7天,在第7天给药测痛后1小时处死各组大鼠,进行荧光免疫组化实验。结果表明,神经病理性疼痛发生发展过程中,大鼠脊髓背角术侧TSPO表达持续增强,钩吻素子可显著降低CCI模型大鼠脊髓背角TSPO表达的水平,作用随剂量增大而增强。此外,荧光免疫双标技术发现在神经病理性疼痛状态下,TSPO在活化的星型胶质细胞中可大量表达,在活化的小胶质细胞也有较高程度的表达,提示在神经病理性疼痛状态下,上调的TSPO有可能主要存在于脊髓背角活化的小胶质细胞和星形胶质细胞。3.TSPO特异性拮抗剂PK11195对钩吻素子抗神经病理性疼痛效应的拮抗作用在CCI模型上,观察单次给予钩吻素子后的镇痛效应。大鼠随机分为5组:假手术+生理盐水组、模型+生理盐水组、模型+钩吻素子组(7mg/kg、1.4 mg/kg、0.28mg/kg)。对于CCI模型合格的大鼠于手术后第9天颈部皮下注射钩吻素子或相应体积的生理盐水,给药体积为0.2 ml/100 g,给药后1h测定各组大鼠的左右两侧后肢足底机械刺激痛阈,以动物术侧足机械刺激痛阈为评价指标进行统计学分析。结果显示,钩吻素子可显著提高CCI模型鼠痛阈,作用呈剂量依赖性,其镇痛效应半数有效量ED50=5.83 mg/kg,其95%可信限为3.53--13.36 mg/kg。在此基础上,观察脊髓鞘内注射PK11195对皮下给予钩吻素子镇痛作用的可能拮抗作用。大鼠分为假手术+生理盐水组、模型+生理盐水组、模型+钩吻素子组、模型+PK11195组、模型+钩吻素子+PK11195(1、0.2、0.04μg)组。CCI手术后第9天,鞘内注射10μl的PK11195后皮下注射钩吻素子溶液,60min后测定痛阈。结果显示,大鼠鞘内注射TSPO拮抗剂PK11195可显著拮抗钩吻素子镇痛效应,作用呈剂量依赖性,提示了钩吻素子抗神经病理性疼痛作用可能与脊髓TSPO的激活有关。4.钩吻素子对[3H]-PK11195与TSPO亲和力的影响采用放射配体受体结合分析法,分析钩吻素子与TSPO的亲和力。放射配体选用[3H]-PK11195,受体组织标本选用大鼠大脑皮层线粒体组分TSPO。饱和实验测算放射配体[3H]-PK11195与TSPO结合反应的解离常数Kd值和最大结合容量Bmax值,并观察钩吻素子在饱和实验中对Kd和Bmax的影响。竞争实验测算钩吻素子竞争性抑制结合反应的半数有效浓度IC50值和解离常数Ki值。结果显示,在饱和试验中[3H]-PK11195与大鼠大脑皮层线粒体组分TSPO结合反应Kd为0.9337±0.1746 n M,Bmax为210.5±14.4 fmol/mg·prot,钩吻素子在浓度10-12-10-9M范围内可显著增加[3H]-PK11195与TSPO结合的Bmax值。竞争实验观察到钩吻素子并未与[3H]-PK11195竞争,反而在一定浓度范围内(约10-12-10-6M)增强了[3H]-PK11195与TSPO的特异性结合,提示钩吻素子可能正性变构调节TSPO。5.钩吻素子对C6胶质瘤细胞孕烯醇酮水平的影响在C6胶质瘤细胞上,观察钩吻素子及TSPO配体对C6胶质瘤细胞孕烯醇酮生成的影响。实验分为对照组(Control组)、配药液组(DMSO组)、PK11195处理组(PK11195)、AC5216处理组(AC5216)、钩吻素子低、中、高剂量组(KM8、KM 40、KM 200μM组)。将C6胶质瘤细胞以105细胞/孔的密度接种于96孔板,与各个药物处理组的培养基孵育2小时,孵育结束后,细胞培养基1500g离心10分钟,ELISA测分泌到培养基中孕烯醇酮含量。结果显示,PK11195和AC5216组C6胶质瘤细胞中孕烯醇酮含量显著增加,钩吻素子3个剂量组8、40、200μM均能显著提高C6胶质瘤细胞孕烯醇酮的水平,作用呈剂量依赖关系,提示钩吻素子可能促进TSPO生成神经甾体发挥药理作用。综上,在神经病理性疼痛发生发展过程中,脊髓背角胶质细胞呈现活化,TSPO表达增强。钩吻素子的抗神经病理性疼痛效应与其抑制脊髓背角星形胶质细胞的活化有关,提示抑制脊髓背角胶质细胞的激活可能是钩吻素子抗神经病理性疼痛的作用机制之一。钩吻素子抗神经病理性疼痛作用与TSPO关系密切:钩吻素子抗神经病理性疼痛作用可能与脊髓背角TSPO的激活有关;钩吻素子可能存在正性变构调节TSPO;钩吻素子可增强TSPO介导的孕烯醇酮合成功能,提示TSPO可能是钩吻素子抗神经病理性疼痛的作用靶点之一。