半纤维素由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体,主要包括木聚糖与甘露聚糖等。半纤维素酶（Hemicellulases）是能使植物细胞壁中除纤维素和果胶物质外的多糖水解的酶类。半纤维素酶可以将半纤维素降解为单糖或低聚寡糖,解除其对营养因子的阻碍作用,进而提高营养成分的可利用率。木质纤维素的降解可以满足不同行业原材料的需求,例如益生元低聚糖、化学品、蛋白质、生物氢和沼气。所以,半纤维素酶对木质纤维素生物质的降解有着巨大的研究价值。阿魏酸酯酶是在微生物中较为常见的一种半纤维素降解酶。利用阿魏酸酯酶处理木质纤维素时,会生成阿魏酸,其具有抗辐射作用、抗氧化功能、抗菌和抗病毒等功能,同时在人体中可起到保护皮肤的作用。由于阿魏酸酯酶的多种生物技术功能,致使其在工业生产中具有极大的利用潜力。但是在现有研究中,阿魏酸酯酶的生产多是从各种微生物中分离和纯化,产量仍然维持在较低水平,更适合用于工业生产的酶活与产量更高的阿魏酸酯酶仍有待开发。大肠杆菌（Escherichia coli）是经典的原核基因表达宿主,具有培养期短、操作方便等优点,是重组蛋白研究和应用的首选。然而,大肠杆菌产生的重组蛋白通常位于细胞质或周质空间。细胞外生产重组蛋白有显著的优势,例如可以简化重组蛋白的纯化,或者有助于重组蛋白在胞外直接发挥作用。本研究基于阿魏酸酯酶在大肠杆菌中可溶性分泌这一现象,优化阿魏酸酯酶的产量与活性,并利用阿魏酸酯酶的N端序列引导其他酶的分泌,构建多酶共表达载体,实现低聚木糖、木糖与阿魏酸的生产,主要体现在以下几个方面:（1）多策略提高阿魏酸酯酶的胞外分泌量。首先,对阿魏酸酯酶FaeLam的DNA序列进行大肠杆菌密码子偏好性优化,构建E.coli BL21/pET22b-Opt-Fae,相比E.coli BL21/pET22b-FaeLam的胞外酶活提高41.97%,胞外酶产量达到2858.85 U/L。构建了级联不同数量T7启动子与更换不同5’UTR的重组菌株,其中级联4个T7启动子与更换A-5’UTR时,对阿魏酸酯酶分泌量的提高尤为明显,相比E.coli BL21/pET22b-Opt-Fae分别提高36.46%与31.25%。随后,使用随机突变试剂盒对N端序列进行随机突变,并且基于阿魏酸酯酶的可溶性分泌现象,筛选出突变株E.coli BL21/pET22b-Opt-Fae C66,相比E.coli BL21/pET22b-Opt-Fae,胞外阿魏酸酯酶分泌量提高20.66%左右,胞外酶活可以达到3449.49 U/L。为了进一步提高阿魏酸酯酶的分泌量,通过免疫共沉淀实验,鉴定出114个阿魏酸酯酶在胞内的结合蛋白,从中筛选出11个分泌辅助因子并且用于阿魏酸酯酶共表达,其中SurA、DanK和TolC的促进分泌作用最为明显,分别使阿魏酸酯酶的胞外产量提高20.09%、23.17%与25.75%。这些结果为阿魏酸酯酶的产量提高奠定了理论基础,为进一步用于工业生产提供可能。（2）定点突变提高阿魏酸酯酶的催化效率。为了提高阿魏酸酯酶的单位活性,得到更适用于生产的阿魏酸酯酶。首先构建了Fae-T40A、Fae-Q134T、Fae-F160A、Fae-G161A、Fae-Q198A与Fae-5×Site等6个阿魏酸酯酶突变体菌株。通过将突变体菌株与原始菌株E.coli BL21/pET22b-Opt-Fae经过诱导表达,使用His-Trap亲和层析柱纯化得到纯酶液进行酶学性质测定,包括最适反应温度、最适pH、温度稳定性和pH稳定性。发现单位点突变对阿魏酸酯酶的酶学性质几乎没有影响,但是Fae-5×Site突变体的酶活急剧下降,这可能是由于多位点突变破坏了阿魏酸酯酶的空间结构。Fae-Q134T与Fae-Q198A的酶活相比原始阿魏酸酯酶FaeLam分别提高39.21%与48.88%,酶活分别可以达到397.99±4.77 U/mg与425.64±5.55U/mg。测定不同酶突变体的动力学参数,比较底物亲和力与底物周转率,提高阿魏酸酯酶酶解效率,其中Fae-Q134T与Fae-Q198A的催化效率相比原始酶分别提高到4.62倍与5.42倍。这些结果为改造更高催化效率的阿魏酸酯酶奠定了理论基础,具有潜在的应用价值。（3）N20序列引导木聚糖酶在大肠杆菌中的分泌表达。通过将噬淀粉乳杆菌来源的阿魏酸酯酶N端20个氨基酸序列（N20）作为信号肽,添加在类地衣芽孢杆菌来源的木聚糖酶的N端,成功在大肠杆菌中实现过表达并分析其酶学性质。其酶学性质的测定表明,该酶的最适反应温度为50℃,最适pH为7.0,然而在最适温度时的温度稳定性较差,但是37℃时温度稳定性较好,这使得可以利用构建的重组菌株E.coli BL21/pET22b-N20Xyl用于木聚糖的同步生长发酵。对木聚糖酶重组菌株进行发酵条件优化,包括培养基、诱导剂浓度、诱导时机、甘氨酸浓度与发酵时间,将木聚糖酶的胞外产量提高到504.12±10.66 U/mL。然后将该菌株用于木聚糖同步生长与发酵,测定发酵液的还原糖含量为8.79±0.10 g/L。TLC与HPLC结果显示主要终产物是木二糖（4.35±0.05 g/L）、木三糖（2.34±0.01 g/L）和木四糖（0.57±0.01 g/L）。随后,使用20株不同的乳酸菌测定XOS的促生长作用。研究的结果显示短小乳杆菌、屎肠球菌、魏斯氏菌与乳酸片球菌可以高效的利用XOS用于生长。这些结果表明,阿魏酸酯酶N端20个氨基酸序列（N20）是一种有效的信号肽,可以实现重组蛋白的胞外生产以及底物的同步发酵,进一步拓宽信号肽的种类。（4）单载体多酶共表达菌株的构建与应用。首先,通过Red/ET重组技术敲除了E.coli BL21的木糖利用基因（木糖异构酶XylA与木糖激酶XylB）,在添加木糖的M9培养基中的生长实验表明,E.coli BL21/ΔxylAB完全丧失木糖利用能力。随后构建木糖苷酶Xys、阿魏酸酯酶FaeLam、木聚糖酶N20Xyl的多酶表达菌株,并对三个酶的顺序进行筛选,通过IPTG（终浓度0.5 mM）诱导后进行综合酶活测定,筛选出最优顺序的重组菌株E.coli BL21/ΔxylAB/pDⅢ-2。将木聚糖以50 g/L浓度添加到培养基中以优化后的发酵条件进行同步生长发酵,最终发酵液的胞外还原糖含量为33.70±0.46 g/L。将得到的发酵液测定了其多项抗氧化能力并配置成特殊MRS培养基用于益生菌培养,其中羟自由基清除能力可以达到80.0%,总抗氧化能力可以达到2.289±0.55。特殊MRS培养基相比于木糖MRS培养基,也更能促进乳酸菌的生长。这些结果为构建单载体多酶共表达菌株提供了依据,使用多酶共表达菌株实现木糖与阿魏酸的生产,具有潜在的应用价值。