辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)是一种极具破坏性的丝状植物病原体,其分布广泛,能够引起全世界范围的辣椒疫霉病,对全球农业和自然生态系统具有重要的影响(Fisher et al.,2012)。当前辣椒疫霉主要以施用化学药剂进行防治,但重金属超标、农药残留等问题日益突出,在解决问题的同时,也给辣椒生产、人类生活健康和生态环境安全带来了巨大的威胁和伤害。因此,利用分子生物学技术探索辣椒疫霉菌重要的致病因子及其致病机制越来越成为研究的热点。提高寄主植物的抗病性是控制辣椒疫霉病的最有效的措施。在辣椒疫霉侵染寄主的过程中,病原菌能够分泌大量的RxLR效应分子,促进和破坏寄主植物的抗病反应。因此,研究RxLR效应分子基因的功能和蛋白结构,对了解辣椒疫霉的致病机制,有效控制辣椒疫霉的侵染具有重要意义。本项研究以本实验室采集并分离保存的高致病性辣椒疫霉菌株SD33为实验材料,结合相关的研究基础,对辣椒疫霉菌株SD33中的细胞周期调控蛋白Pcsda1和Rx LR效应分子基因进行了如下研究:1、利用生物学软件从JGI辣椒疫霉菌基因组数据库中筛选得到Pcsda1基因和Rx LR效应分子基因核苷酸及氨基酸序列,通过NCBI进行BLASTn及BLASTp比对,确定筛选出的基因的正确性。2、从本实验室保存的高致病性辣椒疫霉菌株SD33中提取的基因组DNA中,克隆Pcsda1基因和Rx LR效应分子基因;3、利用软件对Pcsda1基因和Rx LR效应分子基因进行生物信息学预测和分析。4、将Pcsda1基因融合GFP蛋白在辣椒疫霉SD33中表达,发现Pcsda1基因定位在辣椒疫霉SD33的细胞核中,据此,可以推测目的基因Pcsda1通过影响辣椒疫霉菌细胞核的形成和发育,进而影响菌丝及孢子囊的正常生长发育。5、用鬼笔环肽染色法检测Pcsda1基因沉默转化子、过表达转化子和对照转化子的菌丝和孢子囊时期的肌动蛋白细胞骨架,发现沉默转化子和过表达转化子在菌丝和孢子囊中肌动蛋白的分布不规则,过表达转化子中,肌动蛋白的数量增多,尤其是菌丝中,肌动蛋白变成细长、棍棒状、更加明亮。因此,Pcsda1可以调节肌动蛋白斑块和肌动蛋白丝的分布和形态,尤其是在菌丝中。6、利用pBIN-GFP2表达载体对辣椒疫霉Rx LR效应分子进行功能研究,在本氏烟中表达4个候选效应分子,发现其中129113基因可以诱导本氏烟草发生细胞死亡,129113、101860可以抑制Bax、INF1、CRN4诱导的过敏性坏死反应。7、为了进一步研究RxLR的功能,对4个RxLR效应分子进行亚细胞定位,发现定位在细胞核和细胞质中。将129113基因的C端与核输出信号(NES)和核定位信号(NLS1和NLS2)融合,发现NLS2、NES都改变了129113的定位而NLS1没有改变129113的定位。改变129113的定位,影响了其在寄主植物细胞中的功能。推测129113在植物细胞中起作用有可能发生在细胞质中。通过本研究,我们可以推测4个RxLR效应分子在辣椒疫霉的侵染过程中,可以提高植物的敏感性,或者提高植物的抗病性,为研究辣椒疫霉的侵染机制奠定基础。