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目的研究人类锌指蛋白703(ZNF703)在甲状腺乳头状癌中的表达(包括阳性表达率及相对表达量)及阳性表达率与相关临床特征的关系,并在K1型甲状腺乳头状癌细胞中利用si-RNA技术干扰ZNF703的表达,观察细胞转录因子E2F1(E2F1)、细胞周期蛋白E1(CCNE1)及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(P27)的表达变化情况,以探讨ZNF703在甲状腺乳头状癌的形成与进展中的作用与机制。方法1应用免疫组织化学染色法(pv9000法)检测组织芯片(包括36例甲状腺乳头状癌及14例癌旁正常组织)中ZNF703的阳性表达率,并分析甲状腺乳头状癌组织中的阳性表达率与芯片包含的相关临床资料(性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤大小及临床分期)之间的关系。额外收集20例临床新鲜甲状腺乳头状癌及匹配癌旁组织样本,应用western blot及RT-PCR技术检测ZNF703在20对组织样本的蛋白和m RNA相对表达量。2设计合成3对靶向干扰ZNF703基因表达的短RNA系列(si-ZNF703-1、si-ZNF703-2、si-ZNF703-3),以慢病毒为载体转染体外培养的甲状腺乳头状癌K1细胞。设置MOI值(病毒与细胞数目比例值)分别为30、50、70、90,计算相应病毒数量已转染K1细胞,荧光显微镜下观察转染效率,以摸索最佳转染效率时的MOI值,后续试验中转染的细胞均参照此MOI值。设置正常K1细胞为空白对照组、空载体转染的细胞为阴性对照组、si-ZNF703-1、siZNF703-2及si-ZNF703-3转染的细胞分别为实验组1、2、3,实时荧光定量PCR技术检测ZNF703 m RNA的相对表达量以筛选干扰效果最佳的干扰系列。继续大量培养K1细胞,以干扰效果最佳的序列转染的K1细胞为实验组,空白对照组及阴性对照组设置如上,Western-blot检验三组细胞中ZNF703的表达情况,以验证干扰效果,并继续检测三组细胞中P27、CCNE1及E2F1的表达情况。结果1免疫组化结果:ZNF703主要在胞核内表达。ZNF703在甲状腺乳头状癌组织芯片中的阳性表达率(66.7%)高于癌旁正常组织(21.4%),差异具有统计学意义(P<0.05),癌组织中的阳性表达率与患者肿瘤大小、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05),无关于年龄及性别(P>0.05)。2组织RT-PCR、Western-blot结果:ZNF703在22例新鲜甲状腺乳头状癌组织的m RNA(6.399±2.096vs 1.285±0.354,P<0.05)及蛋白(0.893±0.113 vs 0.510±0.072,P<0.05)相对表达量高于匹配癌旁组织。3转染效率的优化及si RNA筛选:荧光显微镜下观察转染效率,以MOI为70时转染效率最佳(>90%)。实验组1、实验组2、实验组3的m RNA相对表达量较空白对照组均下调(0.142±0.013、0.492±0.008、0.550±0.007 VS 0.982±0.032,P<0.05),其中实验组1的下调率为85.5±0.594%(P<0.05),提示沉默干扰效果最佳,空白对照组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。4细胞Western-blot结果:转染72小时后,ZNF703蛋白在实验组的细胞的相对表达量较空白对照组明显下调(0.295±0.015 VS 0.843±0.054,P<0.05),表明si-RNA1序列发挥沉默干扰效果。P27蛋白在实验组较空白对照组表现出明显上调(1.107±0.061 VS 0.493±0.019,P<0.05),而E2F1、CCNE1蛋白的表达量相对于空白对照组下调(0.541±0.036 VS 0.945±0.060、0.630±0.016 VS 0.829±0.040,P<0.05),所有空白对照组与阴性对照组表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论1 ZNF703在甲状腺乳头状癌中的表达情况高于癌旁正常组织,可能作为致癌因子发挥作用,并且与患者肿瘤大小、临床分期及淋巴结转移相关。2ZNF703可能作用P27-E2F1-CCNE1分子通路,调控细胞生长周期改变,从而促进肿瘤发生发展。