研究背景和目的
　　老化相关的血管壁中层钙沉积可造成机体动脉硬度增加、血压升高及多脏器损伤。血管中膜钙化(Vascular medial calcification)是一个与骨发育类似的可调节过程，氧化应激在其发生发展中发挥了关键作用。作为机体抗氧化总管转录因子，核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2)在维持血管稳态和骨形成过程中均发挥着重要作用。伴随增龄，血管系统中NRF2抗氧化功能逐渐下降，这可能是导致衰老血管病理性结构改变和功能失调节的原因之一。然而目前对于NRF2在血管中膜钙化中的调控作用，尤其是在老化相关的血管壁中层钙化中的作用及机制亟待深入研究。本课题着重探索NRF2在血管中膜钙化和血管平滑肌细胞钙化中的作用及机制，并进一步阐述年龄相关性NRF2功能变化是否可能成为衰老影响血管中膜钙化发生发展的原因。
　　实验方法
　　本研究第一部分以小鼠血管平滑肌细胞系(MOVAS1)为基础，建立了高磷诱导的小鼠血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell, VSMC)钙化模型，并通过RNA干扰和慢病毒转染技术敲除及过表达细胞内Nrf2，检测各组钙化程度。本部分实验还通过流式细胞法(Flow cytometry, FCM)检测VSMC内活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, ROS)、线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential, MMP)和细胞凋亡(Apoptosis)水平。本研究第二部分构建了平滑肌特异性敲除Nrf2的转基因小鼠及自然衰老小鼠，通过高嘌呤饮食法成功诱导在体水平血管钙化模型。同时利用高磷体外培养的方法诱导出主动脉环钙化，并使用NRF2激活剂富马酸二甲酯(Dimethyl Formamide, DMF)和特丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone, tBHQ)进行干预，检测各组钙化程度。
　　实验结果：
　　本研究表明，在高磷诱导的细胞钙化模型中，NRF2入核，RT-PCR检测NRF2下游信号Nqo1(P=0.0031)和Hmox1(P=0.0219)表达水平升高。在高磷干预下，敲除Nrf2组VSMC茜素红染色阳性率(P=0.0004)和钙含量(P=0.0002)均高于空载组。外源性表达Nrf2则可部分逆转高磷诱导的钙化，茜素红染色阳性比例(P=0.0016)和钙含量(P=0.0058)较对照组均下降。且过表达Nrf2降低细胞内ROS水平(P<0.0001)，升高细胞线粒体膜电位(P=0.0320)，同时抵抗高磷诱导的细胞早期凋亡(P=0.0153)。
　　第二部分基于平滑肌细胞特异性敲除Nrf2小鼠，利用高嘌呤饮食建立血管中膜钙化模型，结果表明与对照组相比，Nrf2敲除组小鼠的血管钙含量显著增加(P=0.0471)。高磷诱导的Nrf2敲除小鼠主动脉环钙含量也明显高于对照组小鼠(P=0.0001)。与年轻小鼠相比，高磷诱导的年老小鼠主动脉环钙含量增加(P=0.0026)，并伴随NRF2及靶基因NQO1和HMOX1表达量下降(P<0.05)；NRF2激活剂DMF和tBHQ可以明显降低高磷诱导的年老小鼠血管环钙含量(PDMF=0.0146;PtBHQ=0.0118)。
　　结论：
　　NRF2缺乏加剧小鼠血管中膜钙化和VSMC钙化，且NRF2对血管平滑肌细胞钙化的调节作用可能部分通过调控细胞早期凋亡来实现。衰老加速血管中膜钙化的发生并伴随着NRF2抗氧化防御功能的下降。且NRF2激活剂可以改善老年小鼠主动脉中层钙化，说明年龄相关NRF2功能失调可能是衰老加剧血管中膜钙化的原因之一。以NRF2抗氧化途径为靶点的治疗方式为血管中膜钙化，尤其是衰老引起的血管中层钙沉积的预防和治疗提供了新方向。