【摘 要】
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目的:课题组前期通过基因表达序列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression,SAGE）建立正常、哮喘、正常针刺和哮喘针刺4个标签数据库,分析发现了包括钙结合蛋白 S100A9（S100 calcium binding protein A9,S100A9）在内的 21 个针刺抗哮喘差异表达基因。为阐明针刺抗哮喘效应因子S100A9功能,通过检测气道平滑肌细胞增殖情
【基金项目】
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国家自然科学基金（81922076）； 国家自然科学基金（81973951）；
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目的:课题组前期通过基因表达序列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression,SAGE）建立正常、哮喘、正常针刺和哮喘针刺4个标签数据库,分析发现了包括钙结合蛋白 S100A9（S100 calcium binding protein A9,S100A9）在内的 21 个针刺抗哮喘差异表达基因。为阐明针刺抗哮喘效应因子S100A9功能,通过检测气道平滑肌细胞增殖情况下S100A9蛋白表达情况,进一步构建了针刺抗哮喘效应因子S100A9高表达大鼠气道平滑肌细胞,以期明确S100A9调控气道平滑肌细胞增殖效应相关信号通路。方法:分离培养原代大鼠气道平滑肌细胞,采用细胞免疫荧光法对气道平滑肌细胞特异性标志物alpha-actin进行鉴定以明确所用细胞纯度,再利用蛋白免疫印迹法,检测S100A9蛋白经三种不同浓度2.5、25和250ng/ml血小板源型生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF）刺激后在气道平滑肌细胞中的表达量差异;设计S100A9高表达基因序列,通过酶切,胶回收和酶连接等方法将S100A9高表达序列插入至慢病毒载体质粒中,使用基因测序法对载体质粒进行测序,以验证S100A9高表达序列是否准确插入至载体质粒中。使用慢病毒高表达质粒、慢病毒包装质粒对293T工具细胞进行慢病毒包装,包装成功后,超速离心并重悬病毒沉淀,随后测定慢病毒滴度,摸索气道平滑肌细胞最适宜感染复数,然后使用慢病毒对气道平滑肌细胞进行转染,进一步测定最适宜筛选细胞的杀稻瘟菌素浓度以构建S100A9高表达细胞系,采用实时荧光定量PCR法和免疫印迹法验证S100A9高表达细胞系是否构建成功;进一步利用细胞计数法、WST-1（水溶性四唑盐）法和细胞实时分析技术分别验证S100A9高表达后在24、48、72小时等不同时间点对抑制气道平滑肌细胞增殖的生物学效应;利用荧光探针方式检测S100A9高表达后对胞内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平的影响;采用免疫印迹法验证S100A9高表达和正常气道平滑肌细胞NF-κB通路中p65、IκB-α蛋白和p38MAPK蛋白、NOX2和NOX4蛋白表达差异。结果:1.针刺抗哮喘效应因子S100A9在增殖气道平滑肌细胞中的表达差异利用免疫印迹法验证S100A9蛋白检测经PDGF诱导的气道平滑肌细胞中的表达含量差异。结果显示S100A9表达含量随着PDGF浓度的增加而降低。PDGF浓度为2.5、25和250ng/ml时,S100A9蛋白的表达含量分别降至正常细胞的56%、40%和 23%（P＜0.05,n=3）。2.成功构建针刺抗哮喘效应因子S100A9高表达稳转细胞系将S100A9高表达基因序列连接至慢病毒载体中,利用慢病毒转染的方式,使S100A9在气道平滑肌细胞内高表达。按照气道平滑肌细胞的最适宜感染复数40进行细胞筛选,并利用6μg/ml浓度抗生素筛选出本课题所需的S100A9高表达细胞株。荧光视野下,阳性细胞率占90%;经免疫印迹法验证,胞内S100A9蛋白高于正常组4.10倍,即S100A9高表达稳转细胞株构建成功。3.针刺抗哮喘效应因子S100A9高表达抑制气道平滑肌细胞增殖通过细胞计数法发现S100A9高表达组细胞在48和72小时分别显著低于正常组细胞（P＜0.05,n=3）,增殖效应的最大差别时间点出现在72小时,S100A9高表达组低于正常组细胞2.37倍。WST-1法检测发现高表达组细胞增殖率在24、48和72小时均低于正常组细胞（P＜0.05,n=3）,其中72小时差别显著,S100A9高表达组低于正常组1.27倍。RTCA法检测发现高表达组细胞增殖率在24、48和72小时均低于正常组细胞（P＜0.05,n=3）,在72小时时间点最为明显,S100A9高表达组细胞低于正常组细胞1.90倍。三种结果共同提示S100A9高表达后具有抑制气道平滑肌细胞增殖的生物学效应。4.针刺抗哮喘效应因子S100A9高表达降低胞内活性氧水平胞内活性氧总体水平检测发现,S100A9高表达组中荧光细胞面积和总面积比值比正常细胞组比值降低了 1.67倍（P＜0.05,n=3）。5.针刺抗哮喘效应因子S100A9高表达对通路蛋白影响利用免疫印迹法验证S100A9高表达后相应信号通路蛋白影响,发现高表达组细胞内NF-κB通路中p65和IκB-α蛋白分别比正常组显著升高10.51倍、9.06倍（P＜0.05,n=3）,p38MAPK蛋白、NOX2和NOX4表达与正常组无统计学差异。结论:针刺抗哮喘效应因子S100A9胞内高表达具有抑制气道平滑肌细胞增殖的作用,可能与胞内活性氧水平降低,与NF-κB通路p65、IκB-α蛋白表达增高有关。
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