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在脊椎动物中,类固醇激素的合成由一系列类固醇合成酶共同参与调控。类固醇激素合成首先需要将初始底物胆固醇从细胞质基质转运到线粒体内膜,然后在类固醇合成酶的催化作用下合成各种激素。研究表明,底物的运输需要类固醇合成急性调节蛋白（Steroidogenic acute regulatory protein,StAR）的参与。在哺乳类,StAR底物转运过程被认为是调控类固醇合成的第一个限速步骤,在类固醇激素合成过程中发挥至关重要作用。在前期研究中,我们从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）分离出两种StAR基因（StAR1和StAR2）,其中StAR1是哺乳类StAR的直系同源基因,而StAR2是硬骨鱼类的复制基因。StAR1基因主要在精巢Leydig细胞和头肾肾间细胞表达,我们推测StAR1可能在促进精巢雄激素和头肾可的松合成过程中有重要作用。而StAR2只在卵巢间质细胞和精巢Leydig细胞表达,推测StAR2可能在性腺雌激素和雄激素合成过程中具有重要作用。重要的是,我们发现只有StAR2在性别决定和分化早期的XX性腺表达,提出StAR2,而不是StAR1可能调控鱼类性别决定与分化早期雌激素合成的过程。但是到目前为止,关于StAR调控鱼类类固醇合成的直接证据,特别是在硬骨鱼类性腺发育和性别分化过程中的作用,仍需要通过功能实验进一步验证。因此,本论文以尼罗罗非鱼为材料,通过CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术分别建立StAR1和StAR2的突变体,分析了基因突变体性腺组织学形态、基因表达和激素合成水平等变化,以期深入研究两种StAR在罗非鱼类固醇激素合成中扮演的角色,阐明StAR通过调控不同类固醇激素合成,进而调控硬骨鱼类性别决定与分化的分子机制。本论文主要研究结果如下:1)StAR基因突变系的建立。利用CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术,在罗非鱼分别敲除StAR1和StAR2,获得StAR1的杂合突变体和StAR2的纯合突变体。基因敲除的靶位点位于StAR1和StAR2的第2个外显子上,选择靠近PAM（Protospacer adjacent motif,PAM,原型间隔基序）区的限制性内切酶Bsl I和Pst I,分别用于StAR1和StAR2 F0代基因敲除阳性鱼的筛选。将StAR1和StAR2突变的F0代XY阳性鱼和野生型XX雌鱼杂交,获得F1代杂合突变体。选取StAR2移码突变（-8bp）的XY与XX F1代交配获得纯合突变的F2代。2)StAR1基因突变对精子发生和育性的影响。在孵化后90天,野生型XY鱼的精巢充满各时期生殖细胞,包括精原细胞、精母细胞以及精子细胞等,而在StAR1嵌合突变XY鱼的性腺中,未发现进行减数分裂的各级生精细胞,精子发生出现延迟。免疫组化实验结果显示,在StAR1突变的XY性腺中,催化雄激素的合成关键酶和生殖细胞标记基因Vasa的表达明显减少。Real-time PCR结果发现,生殖细胞减数分裂相关的分子标记基因（spo11、piwil1、dazl和Scp3）表达量显著性降低,cyp11b2的表达也下调,并且EIA检测发现血清中11-KT的水平也降低。这些结果表明,StAR1可能在雄激素合成和精子发生过程中有重要作用。我们推测,StAR1突变可能影响了雄激素的合成,进而导致精子发生明显延迟,表明StAR1可能在精子发生启动过程中有重要作用。在孵化后180天,StAR1突变XY鱼的生殖细胞减数分裂部分恢复,可观察到各级生精细胞。将突变XY个体与正常XX个体授精发现,在受精后9天胚胎的存活率为40%左右,表明StAR1基因突变XY个体是可育的。3)StAR2基因突变对精巢分化和精子发生的影响。在孵化后90天,对照组XY性腺充满进行减数分裂的各级生精细胞,而StAR2+/-杂合敲除XY性腺的生殖细胞正常分裂增殖,减数分裂起始也出现延迟。免疫组化结果表明,StAR2+/-精巢中Leydig细胞标记基因Cyp11b2和生殖细胞标记基因Vasa的表达减少,并且精巢中充满表达Dmrt1的Sertoli细胞。这些结果说明在精巢发育早期,StAR2基因的杂合突变同样会导致精巢精子发生的启动过程延迟。在孵化后300天,StAR2+/-精巢中精子发生部分恢复,可见各级生精细胞。免疫组化检测发现,在StAR2+/-性腺检测到精母细胞标记基因PCNA的阳性信号。与对照雄鱼相比,Cyp11b2和Cyp17a2表达的Leydig细胞异常聚集。Real-time PCR检测结果表明,StAR2+/-精巢中生殖细胞相关基因（vasa和pcna）表达量显著降低,而体细胞细胞表达基因cyp11b2和cyp17a2的表达显著上调,表明精巢发育并未完全恢复正常。在孵化后70天和90天的StAR2-/-XY性腺中,组织学观察发现StAR2缺失导致XY精巢发育受阻并且精子发生启动过程延迟。在孵化后120天,StAR2-/-精巢中精小叶发育紊乱,输精管没有形成。免疫组化检测发现,在孵化后70天StAR2-/-精巢中,Vasa仅在少数精原细胞和精母细胞中表达,在StAR2+/+和StAR2-/-精巢都检测到雄性特异基因Dmrt1的表达。Real-time PCR检测结果表明,在孵化后90天,StAR2-/-性腺中生殖细胞减数分裂相关基因（vasa、dazl和sycp3）表达水平显著降低,类固醇合成酶基因cyp11a、cyp17a1和3β-HSD-I以及Sertoli细胞标记基因dmrt1的表达水平未发生显著变化,StAR1的表达水平显著高于对照组,而cyp11b2的表达却显著低于对照组。EIA检测发现StAR2-/-个体血清中11-KT的水平也显著低于对照组。说明StAR2缺失影响了雄性性腺生殖细胞的增殖和精子发生过程。我们认为,StAR2可能在雄激素合成和精子发生中有重要作用。4)StAR2纯合突变对雌激素合成和卵巢发育的影响。在孵化后90天,可以在StAR2-/-纯合突变卵巢中观察到I、II时相卵母细胞,Cyp19a1a的表达与XX野生型相比没有明显差异。然而,在孵化后40天和90天的StAR2-/-卵巢中检测到雄性高表达的基因StAR1,而在野生型卵巢中则检测不到StAR1阳性信号。有趣的是,我们在StAR2-/-卵巢中还检测到精巢Leydig细胞标记基因Cyp11b2的表达。Real-time PCR检测结果表明,StAR2-/-卵巢中减数分裂相关基因vasa和spo11表达水平显著降低,雌激素合成关键酶基因cyp19a1a表达显著降低,StAR1和cyp11b2的表达却明显上调。EIA检测发现StAR2-/-个体血清中E2的水平也降低。同时,在孵化后90天,组织学观察发现,StAR2-/-卵巢发育紊乱,表现为卵母细胞减少,而体细胞增多,表明StAR2可能在雌激素合成和卵巢早期发育中有重要作用。在孵化后120天,免疫组化检测到StAR1和Cyp11b2也表达于StAR2-/-卵巢。实验结果表明,StAR2基因敲除导致卵巢中的体细胞雄性化。但StAR2基因缺失不会引起性逆转,我们推测可能是由于StAR1基因表达上调能够补偿StAR2的功能,参与调节雌激素的合成。因此,还需要建立StAR1和StAR2的双敲除模型开展更进一步的研究。综上所述,我们在尼罗罗非鱼中通过CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术现已获得StAR1突变的F1代杂合子和StAR2突变的F2代纯合子。我们发现StAR1和2缺失在早期阶段会影响精巢发育和精子发生启动延迟过程,我们推测StAR1和StAR2可能都参与调节雄性个体的雄激素合成和精子发生。研究发现,StAR2在XX个体纯合敲除导致卵巢体细胞出现雄性化现象,表明StAR2在卵巢分化早期有重要作用。此外,XX个体并没有发生性逆转,这可能是因为StAR1会补偿其功能在雌激素合成和卵巢发育过程中发挥作用。因此,在本研究的基础上,亟待通过建立筛选StAR1和StAR2双敲除模型,深入解析StAR在雌、雄激素合成和性腺发育过程中的作用。