乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是严重危害人类健康的病原体,其最大的危害性在于HBV慢性持续性感染易发展为肝硬化或肝癌。目前临床上治疗HBV的药物主要有干扰素(interferon,IFN)、核苷类似物(拉米夫定lamivudine等)和免疫调节剂等,但这些治疗方法仅能降低体内的病毒拷贝数,尚不能最终清除体内的乙肝病毒。已有研究表明肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)可以通过非杀细胞的机制抑制HBV的复制,可能的机制为TNF-α激活NF-K B通路进而影响病毒核心颗粒的包装。本室刘晓颖博士利用基因芯片技术筛选TNFα处理后的HepG2细胞基因表达谱,发现clAP2 (cellular inhibitor of apoptosis protein 2)蛋白可以被显著诱导,且过表达此蛋白能够抑制HBV的复制,进一步研究发现cIAP2能够下调HBV RNA水平；鉴于clAP2蛋白为E3连接酶,能介导蛋白降解,因此将表达clAP2(?)口HBV各编码蛋白的质粒共同转染入细胞中,发现clAP2可以特异性地下调HBV多聚酶(polymerase)的水平。本课题在此基础上拟进一步明确其分子机制。首先通过过表达的方法确认了在肝细胞体系中clAP2可以显著下调HBV多聚酶的水平。进一步运用RNA干扰技术发现特异性干扰Huh7和Hela细胞中内源性clAP2蛋白的表达后,HBV多聚酶水平可得到部分回复。鉴于clAP2蛋白由BIR结构域、CARD结构域和RING结构域组成,为了解clAP2下调多聚酶蛋白水平的结构域,研究中分别构建了clAP2蛋白各个结构域的截短突变体,与HBV多聚酶表达质粒共转染入细胞中,实验结果表明clAP2蛋白的BIR2和RING结构域与其下调多聚酶水平的作用相关。由于文献报道clAP2蛋白的C端RING结构域具有E3连接酶活性,可以促进特定的底物泛素化导致底物的降解,进一步构建了clAP2 E3功能缺失突变质粒,将其与HBV多聚酶共转染入Huh7细胞,发现此突变体不能下调多聚酶的表达水平,提示clAP2下调多聚酶表达水平作用和其RING结构域E3连接酶活性相关。clAP2若作为HBV多聚酶的E3连接酶,这两者之间应存在着相互作用。为证实此推测,构建了含GST标签蛋白的clAP2及各个截短体质粒并经原核诱导表达及纯化。GST-pull down实验结果提示clAP2和HBV多聚酶蛋白在体外有着直接的相互作用,并且这种相互作用由clAP2的BIR2和BIR3结构域介导。同时免疫荧光实验提示HBV多聚酶主要定位于细胞浆,并与clAP2蛋白存在部分共定位。为检测clAP2是否可以作为E3连接酶介导泛素分子连接在HBV多聚酶上并导致其泛素化而降解,进一步采用了体内泛素化实验,结果证实clAP2可以促进HBV多聚酶的泛素化增强。已知泛素分子连接到底物上通常有两种模式：通过底物内部的赖氨酸位点连接或底物的N末端残基连接。结合本课题组的实验结果：HBV多聚酶的不稳定性主要由于其TP和RH结构域介导,本研究中首先将TP和RH结构域上的赖氨酸位点突变为精氨酸,结果显示突变后的多聚酶仍然能被clAP2降解,提示clAP2介导泛素分子连接HBV多聚酶可能不通过其内部的赖氨酸位点。进一步研究表明在HBV多聚酶N末端连接上大分子标签可以使蛋白稳定,提示HBV多聚酶的不稳定性是由于其N端效应造成。综上所述,本文首先通过瞬时转染实验及RNA干扰技术明确了clAP2蛋白可以下调HBV多聚酶蛋白水平的现象,并进一步探讨了其可能机制；通过clAP2各截短体质粒与多聚酶瞬时共转实验发现clAP2的BIR2和RING结构域对于其发挥降解作用尤为重要；且clAP2与HBV多聚酶存在相互作用,主要由BIR2和BIR3结构域介导；此外,clAP2可以介导泛素分子连接到HBV多聚酶的N末端氨基酸残基上导致多聚酶泛素化并将其降解。上述研究部分揭示了体内泛素相关蛋白clAP2下调HBV多聚酶蛋白水平的机制,并可为临床治疗乙型肝炎和寻找潜在的药物靶点提供了理论和实验依据。