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据报道,小鼠Sohlh1基因的敲除会导致雄性不育和雌性不孕,而在猪上还没有相关的报道。RNA引导的核酸酶CRISPR/Cas9是生物学研究中的一项革命性技术,它可以切割活细胞或者组织基因组特异性的DNA靶位点。本研究采用Tet-on系统和CRISPR/Cas9技术建立条件诱导型敲除猪Sohlh1基因的细胞系,以期为后期制备基因敲除克隆猪模型、研究Sohlh1对猪生殖和发育的影响奠定基础。本研究首先优化Cas9基因为eSpCas9(1.1)基因并改造plv-sgRNA载体,通过慢病毒包装PCW-eSpCas9(1.1)载体,侵染猪胎儿成纤维细胞并进行药物筛选;然后通过测序分析猪Sohlh1基因CDs区,并预测Sohlh1基因Cas9蛋白靶位点,构建U6-sgRNA瞬时表达元件转染已稳定整合Cas9基因的细胞,分析各靶位点的敲除活性。最后,浓缩的plv-sgRNA-2A-GFP特异性慢病毒液侵染转eSpCas9(1.1)基因猪胎儿成纤维细胞,药物及荧光检测筛选阳性细胞。试验结果表明,(1)通过测序分析及荧光检测,低脱靶率的PCW-eSpCas9(1.1)载体和有荧光标记的plv-sgRNA-2A-GFP载体优化改造成功;(2)PCW-eSpCas9(1.1)慢病毒转染的阳性细胞,经Dox诱导检测有Cas9表达,转Cas9猪胎儿成纤维细胞筛选成功;(3)PCR扩增测序对比分析猪Sohlh1基因CDs区序列与NCBI报道的数据基本一致;(4)瞬时转染试验验证可以看出猪Sohlh1基因3、4、6号靶位点有敲除活性,5号位点无敲除活性或敲除活性低,选择构建3、4号靶位点的sgRNA特异性慢病毒载体;(5)sgRNA特异性载体慢病毒原液侵染293FT细胞有荧光表达,慢病毒载体包装成功;(6)sgRNA慢病毒浓缩液侵染转eSpCas9(1.1)的阳性细胞,Dox诱导后,经测序分析Sohlh1基因有敲除,可诱导型Sohlh1基因敲除细胞系构建成功。综上所述,本研究获得的可诱导型Sohlh1基因敲除细胞系对后期基因敲除克隆猪的制备及相关疾病的研究有非常重要的意义,同时有助于研究Sohlh1基因对生殖发育的调控作用。