目的:雄激素剥夺治疗(Androgen deprivation therapy,ADT)是目前前列腺癌(PCa)治疗中一种主要的治疗策略,但持续的作用会使患者产生耐受,进而发展成难治的去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。雄激素受体(androgen receptor,AR)拮抗剂和其他化疗药物一样可以起到延缓病情的作用,但最终也会因为药物抵抗而再次发生治疗失败。大量研究表明,Caveolin-1(Cav-1)在多种肿瘤中异常表达,但是它与CRPC的进展之间是否存在一定的关系,目前尚不完全清楚。因此,随着精准医疗的来临,探讨Cav-1是否可以成为预测和治疗CRPC的关键分子,及其在CRPC发展过程中的作用机制,并为CRPC的诊疗寻找新的途径成为本研究的目的所在。方法:(1)收集2010年1月到2018年8月在重庆医科大学附属第一医院泌尿外科就诊、手术或穿刺的患者病理标本,其中原发性前列腺癌(Primary prostate cancer,PPC)标本45例,CRPC标本36例。通过免疫组织化学法(IHC)检测Cav-1和Ras信号通路中相关因子的表达情况,同时统计分析Cav-1和H-Ras、K-Ras、PLCε之间的表达相关性,以及Cav-1表达与患者的人口学特性、临床特征和生存情况之间的关系。(2)收集2016年12月到2018年8月在重庆医科大学附属第一医院泌尿外科就诊的70例PPC和56例CRPC患者手术前的血清标本。酶联免疫吸附试验(ELISA)分析患者血清中Cav-1的表达情况,并通过受试者工作曲线(ROC)及曲线下面积(AUC)判断Cav-1作为CRPC诊断标志物的可行性,敏感性和特异性。同时分析CRPC患者中Cav-1的水平和患者临床参数之间的关系。(3)构建LNCaP源性且对比卡鲁胺耐药的细胞(Bic-R细胞)和对恩杂鲁胺耐药的细胞(En-R细胞)。Western blot和RT-qPCR检测激素敏感型LNCaP细胞,激素非敏感型PC3细胞、DU145细胞,和对AR受体拮抗剂耐药的Bic-R、En-R细胞中Cav-1的表达情况。构建Cav-1敲低质粒并转染入细胞,Western blot检测与侵袭和迁移相关因子的表达情况,Transwell和划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力。CCK-8实验检测敲低Cav-1后,Bic-R和En-R细胞的增殖情况和比卡鲁胺或恩杂鲁胺对细胞50%抑制浓度的改变。(4)选择PC3细胞和En-R细胞。(1)设置空白组,阴性对照组和Cav-1敲低组,提取细胞总蛋白,去污剂不可溶性膜蛋白(DRF)和去污剂可溶性蛋白(DSF),Western blot检测DRF中Ras的两个亚基因H-Ras、K-Ras及其下游因子PLCε的表达情况;(2)单独使用H-RasG12V(或K-RasG12V)过表达质粒或联合使用H-RasG12V(或K-RasG12V)过表达质粒和Cav-1敲低质粒处理细胞,Western blot检测DRF中Ras信号下游因子PLCε的表达情况;(3)单独使用PLCε敲低慢病毒或联合使用PLCε敲低慢病毒和Cav-1敲低质粒处理细胞,Western blot检测与侵袭和迁移相关因子(MMP2、MMP9、Snail)表达情况,Transwell实验测定细胞的侵袭能力。在Bic-R和En-R细胞中,单独使用Cav-1敲低质粒或联合使用Cav-1敲低质粒和H-RasG12V过表达质粒处理细胞,CCK8检测比卡鲁胺或恩杂鲁胺对细胞的作用效果。(5)选择PC3细胞和En-R细胞。(1)采用无血清培养基培养细胞,以排除外源性胆固醇的影响,并不同浓度的药物处理细胞:辛伐他汀(Simvastatin),10μM;甲基-β-环糊精(M-β-CD),10mM;胆固醇(Cholesterol),10μM。Western blot和免疫荧光检测Cav-1的表达情况。(2)不同浓度的辛伐他汀(0μM,1μM,10μM,20μM)处理细胞,Western blot检测HMGCoAR和Cav-1的表达情况。(3)在Bic-R和En-R细胞中,使用不同浓度的比卡鲁胺(恩杂鲁胺)(2.5μM,5μM,10μM,20μM,30μM,40μM),辛伐他汀(2.5μM,5μM,10μM,20μM,30μM,40μM),或辛伐他汀与比卡鲁胺(恩杂鲁胺)联用(1:1),CCK8检测不同药物或药物合剂对细胞生存能力的影响。结果:(1)CRPC组织中,Cav-1,H-Ras,K-Ras和PLCε的表达与PPC相比,均明显上调(分别为P=0.002,P=0.0272,P=0.0377和P=0.0364),而且在CRPC组织中,Cav-1表达水平与H-Ras(r=0.4151,P=0.0118),K-Ras(r=0.3443,P=0.0398)和PLCε(r=0.4338,P=0.0082)表达水平之间存在正相关。同时通过对患者的人口统计学和临床病理特征进行分析发现,Cav-1阳性表达与患者的骨转移呈正相关(PPC:P=0.021,CRPC:P=0.006)。对36例CRPC患者进行Kaplan-Meier生存分析显示,在CRPC患者中,Cav-1阴性患者的中位无复发生存期(recurrence-free survival,RFS)为36个月,而Cav-1阳性患者中位RFS为25个月,提示Cav-1阳性与较短的RFS相关(P=0.013)。单变量Cox比例风险回归分析显示Cav-1是ADT后CRPC复发的独立危险因素(HR=2.65,95%CI=1.162-6.029,P=0.02)。(2)检测PPC和CRPC患者血清中Cav-1表达发现,CRPC患者血清中Cav-1的表达明显高于PPC患者(CRPC,1.57±0.83 ng/ml;PPC,0.64±0.25 ng/ml;P<0.001)。ROC曲线表明血清Cav-1可用作CRPC的诊断生物标志物(AUC=0.876),当Cav-1的诊断的阳性临界值为0.68ng/ml时,其诊断的敏感性为82.1%,特异性为80%。同时,通过对CRPC患者中Cav-1水平与相关临床参数进行统计学分析发现,Cav-1表达增加与肿瘤转移呈正相关(P=0.003)。(3)Western blot和RT-qPCR检测发现,Cav-1在LNCaP细胞中低表达,在PC3细胞、DU145细胞、Bic-R和En-R细胞中表达均较LNCaP细胞明显增高,差异具有统计学意义。敲低Cav-1后,Western blot检测显示Snail,MMP2,MMP9(与侵袭和迁移相关的因子)表达明显下调,Transwell和划痕实验显示细胞的侵袭和迁移能力明显降低。CCK-8实验显示,敲低Cav-1后,Bic-R和En-R细胞的增殖能力明显减弱。比卡鲁胺和恩杂鲁胺对Bic-R和En-R细胞的抑制强度明显增加。说明敲低Cav-1后可以抑制CRPC细胞转移和对AR拮抗剂的抵抗。(4)Western blot检测发现,敲低Cav-1后,DRF中Ras的两个亚基因H-Ras、K-Ras及其下游因子PLCε的表达明显下调;H-RasG12V和K-RasG12V过表达质粒均促使DRF中PLCε表达的增加,但只有H-RasG12V引起的增加可以被敲低Cav-1而抑制。说明Cav-1对PLCε的影响是通过H-Ras来实现。同时Western blot检测显示,敲低PLCε可明显下调与侵袭和迁移相关因子(MMP2、MMP9、Snail)表达,同时敲低Cav-1只能降低DRF中PLCε的表达,不能影响DSF中PLCε的表达,而且联合敲低Cav-1和PLCε可以增强敲低PLCε对侵袭和迁移相关因子(MMP2、MMP9、Snail)影响。说明Cav-1可以通过调节细胞膜脂筏中PLCε的表达影响细胞的侵袭和转移能力。CCK8显示,比卡鲁胺(或恩杂鲁胺)对耐药细胞的生存能力已不再产生影响,但在敲低Cav-1情况下,比卡鲁胺(或恩杂鲁胺)可以明显抑制细胞生存能力,而且在敲低Cav-1情况下补充H-RasG12V,可以适度的逆转在敲低Cav-1情况下比卡鲁胺(或恩杂鲁胺)对细胞生存能力的抑制作用,说明敲低Cav-1可以增强比卡鲁胺(或恩杂鲁胺)的治疗效果,而且这个过程部分受激活的H-Ras的影响。(5)Western blot和免疫荧光检测显示,两种降低细胞内胆固醇的药物(辛伐他汀和甲基-β-环糊精)均可抑制细胞膜Cav-1的表达,而补充胆固醇使细胞膜Cav-1的表达明显增加。而且,不同浓度的辛伐他汀对细胞内HMGCoAR和Cav-1的影响呈剂量依赖性,说明细胞膜Cav-1的表达受胆固醇的调节。同时CCK8结果显示,辛伐他汀可以抑制耐药细胞的生存能力,如果和比卡鲁胺(恩杂鲁胺)联用,可以起到协同作用,增强比卡鲁胺(恩杂鲁胺)的治疗效果。结论:本研究探讨了细胞膜Cav-1/H-Ras/PLCε信号通路对CRPC转移和耐药性的影响。Cav-1可作为CRPC很有前途的预测性肿瘤标志物,并成为候选的治疗靶点,可用于鉴定需要更强化治疗的患者。而且,辛伐他汀可成为CRPC发展的抑制剂,通过调节Cav-1的表达延迟CRPC的转移和对AR拮抗剂的抵抗。