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目的从SD大鼠脂肪组织中分离得到间质干细胞,为后续研究提供种子细胞。方法1.从SD大鼠的腹股沟部位切取脂肪组织,结合酶消化法获得一群细胞。2.经免疫磁珠系统分选后体外培养,观测其形态学特征及鉴定细胞表面标记。结果1.获取的细胞呈现类成纤维细胞样,可在体外稳定扩增传代。2.获取的细胞表面标志符合目前公认的间质干细胞表型特征。结论通过机械分离结合酶消化的方法,经分选后成功获得SD大鼠ADSCs,可体外培养,为后续研究提供种子细胞。目的探讨LIPUS对体外分离培养的大鼠ADSCs增殖及成骨分化的影响。方法1.流式细胞仪检测阴性对照组和LIPUS组中1d、2d、3d、4d和5d时ADSCs细胞周期分布,计算增殖指数。2.CCK-8法检测阴性对照组和LIPUS组1d、3d、5d和7d时细胞计数,比较增殖程度。3.设置阴性对照组、LIPUS组、成骨诱导组及LIPUS联合成骨诱导组,于LIPUS刺激7d、14d时测定各组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性；于LIPUS刺激21d时采用Von kossa染色比较各组钙结节形成。4. RT-PCR检测阴性对照组和LIPUS组1d、3d、5d和7d时成骨相关基因(包括Runx2、ALP、OC、BSP、Coll Ⅰ)的表达。5. Western blot检测阴性对照组和LIPUS组7d和14d时成骨相关蛋白(包括Runx2和BSP)的表达。结果1. LIPUS组细胞增殖指数4d和5d时较对照组提高。2. LIPUS组细胞增殖程度3d、5d和7d时较对照组加快。3. LIPUS组ALP活性7d或14d时较对照组提高,但低于成骨诱导组及LIPUS联合成骨诱导组；成骨诱导组与LIPUS联合成骨诱导组间差异无统计学意义；另外各组细胞ALP活性测定结果在上述2个时间点间组内差异均无统计学意义。LIPUS作用能致ADSCs形成矿化结节,但其矿化结节数量不及成骨诱导组和LIPUS联合成骨诱导组。4. LIPUS组3d、5d或7d后,Runx2和ALP mRNA的表达增加；5d或7d后,LIPUS组BSP和OCN mRNA也表达增加；没有观察到Coll Ⅰ mRNA的改变。5. LIPUS作用7d和14d后,Runx2和BSP蛋白表达量均增加,BSP蛋白表达的增加从7d维持到14d。但14d后Runx2蛋白量较7d时稍有下调。结论LIPUS能加速大鼠ADSCs增殖,促进大鼠ADSCs向成骨细胞分化。β-catenin shRNA陧病毒载体构建和沉默β-catenin基因效果检测目的构建慢病毒载体,沉默大鼠脂肪源干细胞β-catenin基因表达,为分析经典的Wnt通路在LIPUS促进大鼠ADSCs成骨分化中的作用提供基础。方法1.针对大鼠ADSCs的β-catenin基因设计出3种shRNA打靶序列,分别构建3种pCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi质粒载体,转染至大鼠ADSCs,筛选出最有效的shRNA打靶序列。2.构建含有该shRNA序列的慢病毒载体。3.用慢病毒载体转染大鼠ADSCs。4.检测慢病毒载体转染后,沉默β-catenin基因的效果。结果1.用质粒载体筛选出有效的β-catenin基因shRNA序列。2.用构建病毒载体转染大鼠ADSCs后,可有效沉默β-catenin基因。结论一种较为经济的方法,稳定转染,沉默大鼠脂肪源干细胞β-catenin基因。藉此可分析经典的Wnt通路在LIPUS促进大鼠ADSCs成骨分化中的作用。经典Wnt信号通路在LIPUS促进大鼠ADSCs成骨分化中的作用目的初步探讨经典的Wnt/β-catenin信号通路在LIPUS促进大鼠ADSCs成骨分化过程中的作用。方法1. Real-time PCR检测正常ADSCs组、未转染刺激组、转染刺激组1d、3d、5d和7d时成骨相关基因(包括Runx2、ALP、BSP、Coll Ⅰ)的表达；2. Western blot检测正常ADSCs组、未转染刺激组、转染刺激组7d和14d时成骨相关蛋白(包括Runx2和BSP)的表达。结果1.正常的ADSCs在不接受LIPUS刺激的情况下,所有基因基本呈现一致表达。2.未转染刺激组3d、5d和7d后Runx2基因的表达出现上调；转染刺激组3d、5d和7d后Runx2基因的表达也同样出现上调,但上调的幅度下降。3.未转染刺激组3d、5d和7d后出现ALP基因表达的上调；转染刺激组3d、5d和7d后也同样出现较一致的上调,上调的幅度无下降。4.未转染刺激组5d和7d后出现BSP基因的上调表达；转染刺激组5d和7d后也同样出现上调,但上调的幅度有所下降。5.而三组之间,Ⅰ型胶原基因的表达始终没有明显的变化。6.未转染刺激组和转染刺激组在7d和14d后,均出现Runx2蛋白的表达水平增加,但14d后增幅稍低；转染刺激组与未转染刺激组相比,7d时增幅低。7.未转染刺激组7d和14d后,出现BSP蛋白表达增加；转染刺激组仅14d后,出现BSP蛋白增加。结论有效沉默大鼠ADSCs的β-catenin基因,阻断经典的Wnt通路后,能部分抑制LIPUS对ADSCs的促成骨分化。经典的Wnt通路在LIPUS促进对体外分离培养的大鼠ADSCs成骨分化中,仅起着部分的作用。